Quantificando partículas semelhantes a vírus norovírus humanos ligando-se a bactérias commensal usando citometria de fluxo
Summary
O objetivo deste protocolo é quantificar a ligação do norovírus humano eucaiótico às bactérias. Após a realização de um teste inicial de fixação vírus-bactéria, a citometria de fluxo é usada para detectar bactérias viralmente ligadas à população.
Abstract
As bactérias commensal são bem estabelecidas para impactar a infecção de vírus eucaióticos. A ligação direta entre o patógeno e o microbioma hospedeiro é responsável por alterar a infecção para muitos desses vírus. Assim, caracterizar a natureza da ligação vírus-bactérias é um passo fundamental necessário para elucidar os mecanismos pelos quais as bactérias alteram a infecção viral. Para norovírus humano, bactérias commensal aumentam a infecção celular B. O vírus se liga diretamente a essas bactérias, indicando que essa interação direta está envolvida no mecanismo de aumento da infecção. Uma variedade de técnicas pode ser usada para quantificar interações entre bactérias e vírus, incluindo a contagem de cintilação de vírus rotulados por radiorótulos e reação em cadeia de polimerase (PCR). Ambos os métodos requerem o uso de vírus vivo, que pode precisar ser gerado em laboratório. Atualmente, nenhum dos sistemas de cultura in vitro estabelecidos disponíveis para norovírus humano são robustos o suficiente para permitir a geração de estoques virais altamente concentrados. Em vez de vírus vivos, partículas semelhantes a vírus (VLPs) têm sido usadas para caracterizar as interações entre norovírus e bactérias. Aqui, um método de citometria de fluxo é descrito com o uso de anticorpos específicos do vírus para quantificar a ligação VIP a bactérias gram-negativas e gram-positivas. A inclusão de controles apenas de bactérias e isótipo permitiu a otimização do ensaio para reduzir a ligação de anticorpos de fundo e a quantificação precisa do apego VIP às bactérias testadas. Altas relações de VLP:bactérias resultam em VLPs vinculando-se a grandes percentuais da população bacteriana. No entanto, quando as quantidades de VIP são diminuídas, o percentual de bactérias ligadas também diminui. Em última análise, esse método pode ser empregado em experimentos futuros elucidando as condições específicas e componentes estruturais que regulam o norovírus: interações bacterianas.
Introduction
Os norovírus humanos (HuNoVs) são a principal causa de doenças gastrintestinais em todo o mundo, responsáveis por 685 milhões de infecções e mais de 200.000 mortes a cada ano1. Assim como outros vírus entéricos, a presença de bactérias commensal tem sido demonstrada para aumentar a infecção deste patógeno, bem como seu vírus substituto, murine norovirus2,3. Há também relatos conflitantes de que as bactérias podem inibir a infecção por norovírus humano4,5,6. Para vários vírus, a interação direta entre o vírus e as bactérias parecem estar por trás dos mecanismos que impactam a infecção viral2,7,8,9,10, e tem sido mostrado através da microscopia eletrônica que os norovírus humanos se ligam diretamente às superfícies das bactérias11,12. Portanto, caracterizar essas interações tornou-se fundamental para determinar os mecanismos pelos quais as bactérias impactam a infecção viral. Essa caracterização começou de forma clássica com a quantificação da ligação viral a uma matriz de espécies bacterianas componentes do microbioma hospedeiro7,,12,13. Esses ensaios de apego não apenas revelam a quantidade de vírus ligado às bactérias, mas também ajudam a determinar o impacto dessa interação na aptidão viral e na sobrevivência.
Para quantificar o apego viral, os métodos tradicionalmente utilizados incluem ensaios baseados em PCR que quantificam genomas virais12 ou a geração de vírus rotulados por radiovém e o uso da contagem de cintilação para quantificar partículas virais7,,8,9,13. O uso desses métodos geralmente requer acesso a estoques de vírus de alto título e técnicas de cultivo in vitro com as quais gerá-los. Embora existam agora vários sistemas de cultura para norovírus humano2,14,15, nenhum suporta a replicação robusta necessária para gerar esses estoques altamente concentrados que restringe ou elimina o uso de PCR e contagem de cintilação para quantificar as interações norovírus/bacterianas humanas.
Para contornar esse problema, partículas semelhantes a vírus (VLPs) podem ser usadas como substituto para o vírus vivo para investigar interações entre norovírus humano e bactérias16,17. VIPs são partículas não infecciosas que se assemelham ao vírus do qual são derivados. No caso do norovírus humano, essas partículas são geradas a partir da expressão da proteína VP1 (e às vezes a VP2), que se auto-monta para criar capsídeos virais intactos sem material genético (ou seja, RNA para norovírus). Estes VIPs têm sido bem caracterizados, são estruturalmente e antígenicamente semelhantes aos vírus do tipo selvagem dos quais são derivados18,,19,20,21,22,23. Portanto, os VIPs servem como substituto ideal para investigar as interações superficiais entre norovírus humano e bactérias commensal. Dado que os VIPs não possuem material genético, os ensaios baseados em PCR não podem ser usados para quantificar a ligação viral. Um método de citometria de fluxo baseado em anticorpos foi previamente descrito e capaz de detectar baixos níveis de ligação VIP a bactérias de forma semi-quantitativa16. Este método foi otimizado para permitir a quantificação precisa da ligação vip de norovírus humano tanto para as bactérias gram-negativas quanto gram-positivas16.
Protocol
Representative Results
Discussion
A capacidade de quantificar a ligação de vírus entéricos às bactérias é um primeiro passo crítico para elucidar os mecanismos pelos quais essas bactérias alteram a infecção viral. Os métodos descritos aqui foram otimizados para medir as interações do norovírus humano COM e. cloacae (bactéria gram-negativa) e L. gasseri (uma bactéria gram-positiva), mas podem ser adaptados para uso com qualquer vírus mamífero e bactéria de interesse. Embora os VIPs sej…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Sutonuka Bhar e Chanel Mosby-Haundrup por sua revisão crítica do manuscrito escrito, bem como A favor de Alfonso Carrillo pela assistência na geração de curvas padrão bacterianas. Este trabalho é financiado em parte por uma bolsa do Instituto Nacional de Saúde (R21AI140012) e por uma bolsa semente da Universidade da Flórida, Instituto de Ciências Alimentares e Agrícolas.
Materials
| 5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap | Corning | 352235 | After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis. |
| Agar | Sigma | A7002 | Used for media preparation |
| AnaeroPack | Thermo Scientific | R681001 | Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri |
| BD FacsDiva software | |||
| BD LSR Fortessa flow cytometer | |||
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605 | Used for flow cytometry |
| Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) | BD Biosciences | 554657 | Used for flow cytometry |
| Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience | Thermo Fisher Scientific | 12473281 | Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer. |
| MRS Powder | BD Biosciences | 288130 | Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri. |
| Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) | Thermo Fisher Scientific | MA5-18241 | Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher. |
| Norovirus GII.4 VLP | Creative Biostructure | CBS-V700 | human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays. |
| PBS 10X | Fisher Bioreagents | BP665 | Dilute to 1X prior to use. |
| SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | S10467 | Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody. |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Used for media preparation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Used for media preparation |
| Tube Revolver | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm). |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | Used for media preparation |
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