Doble en electroporación de utero para apuntar a poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente
Summary
La electroporación doble en el útero permite apuntar a las poblaciones celulares que están separadas espacial y temporalmente. Esta técnica es útil para visualizar las interacciones entre las poblaciones celulares que utilizan proteínas fluorescentes en condiciones normales, pero también después de experimentos funcionales para perturbar los genes de interés.
Abstract
En la electroporación del útero es una técnica de transferencia de ADN in vivo ampliamente utilizada para estudiar los mecanismos moleculares y celulares subyacentes a la corticogénesis de los mamíferos. Este procedimiento aprovecha los ventrículos cerebrales para permitir la introducción del ADN de interés y utiliza un par de electrodos para dirigir la entrada del material genético hacia las células que recubren el ventrículo, las células madre neurales. Este método permite a los investigadores etiquetar las células deseadas y/o manipular la expresión de genes de interés en esas células. Tiene múltiples aplicaciones, incluyendo ensayos dirigidos a la migración neuronal, rastreo de linaje y búsqueda de rutas axonales. Una característica importante de este método es su control temporal y regional, permitiendo la elusión de posibles problemas relacionados con la letalidad embrionaria o la falta de ratones conductores de CRE específicos. Otro aspecto relevante de esta técnica es que ayuda a reducir considerablemente las limitaciones económicas y temporales que implican la generación de nuevas líneas de ratón, que se vuelven particularmente importantes en el estudio de las interacciones entre los tipos celulares que se originan en áreas distantes del cerebro a diferentes edades de desarrollo. Aquí describimos una estrategia de electroporación doble que permite la focalización de poblaciones celulares que están separadas espacial y temporalmente. Con este enfoque podemos etiquetar diferentes subtipos de células en diferentes ubicaciones con proteínas fluorescentes seleccionadas para visualizarlas, y/o podemos manipular genes de interés expresados por estas diferentes células en los momentos adecuados. Esta estrategia mejora el potencial de la electroporación del útero y proporciona una poderosa herramienta para estudiar el comportamiento de las poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente que migran para establecer contactos cercanos, así como las interacciones de largo alcance a través de proyecciones axonales, reduciendo los costos temporales y económicos.
Introduction
La corteza cerebral es una estructura muy compleja e intrincadamente organizada. Para lograr tal grado de organización, las neuronas de proyección cortical pasan por complejos procesos de desarrollo que requieren su generación temporal, la migración a su destino final en la placa cortical, y el establecimiento de conexiones de corto y largo alcance1,,2. Durante mucho tiempo, la forma clásica de estudiar la corticogénesis se basó en el uso de modelos murinos knockout o knock-in de genes de interés. Sin embargo, esta estrategia, y en particular el uso de ratones noqueadores condicionales, consume mucho tiempo y es costosa, y a veces presenta problemas adicionales con respecto a la existencia de redundancia genética o la falta de controladores CRE específicos, entre otras cuestiones. Uno de los enfoques que surgieron para tratar de abordar esos problemas y que hoy en día se utiliza ampliamente para estudiar el desarrollo cortical es en la electroporación del útero3,,4. En electroporación del útero es una técnica utilizada para la transgénesis somática, permitiendo la focalización in vivo de las células madre neurales y su progenie. Este método se puede utilizar para etiquetar las célulasmediantela expresión de proteínas fluorescentes 5,6, para la manipulación de genes in vivo (es decir, ensayos de ganancia o pérdida de función)7,8,9, para aislar cortices electroporados in vitro y células de cultivo8,10. Además, en la electroporación del útero permite el control temporal y regional de la zona objetivo. Esta técnica tiene numerosas aplicaciones y ha sido ampliamente utilizada para estudiar la migración neuronal, división de células madre, conectividad neuronal, y otros sujetos8,9,11,12.
El manuscrito actual describe el uso de una variante de electroporación in utero, llamado double in utero electroporation, para analizar las interacciones de las células en la corteza cerebral con diferentes orígenes temporales y espaciales. Estos estudios son extremadamente complejos de completar al emplear modelos murinos porque requieren el uso combinado de varias líneas transgénicas. Algunas de las aplicaciones del protocolo descrito en este documento incluyen el estudio de interacciones cercanas entre las células vecinas, así como las interacciones entre células distantes a través de proyecciones de largo alcance. El método requiere realizar dos cirugías independientes en electroporación del útero, separadas temporal y espacialmente, en los mismos embriones para dirigirse a diferentes poblaciones celulares de interés. La ventaja de este enfoque es la posibilidad de manipular la función génica en uno o ambos tipos de neuronas que utilizan animales de tipo salvaje. Además, estos experimentos funcionales se pueden combinar con la expresión de proteínas fluorescentes citoplasmáticas o etiquetadas por membrana para visualizar la morfología fina de las células objetivo, incluidas las dendritas y los axones, y analizar posibles diferencias en las interacciones celulares en comparación con un control (es decir, células etiquetadas únicamente con la proteína fluorescente).
El protocolo delineado aquí se centra en el estudio de las interacciones celulares dentro del neocortex, pero esta estrategia también podría utilizarse para examinar las interacciones con áreas extracorticales que se pueden apuntar utilizando la electroporación del útero, como el subpallium o el thalamus13,,14,o interacciones célula-célula en otras estructuras, como el cerlumín15. La focalización de diferentes áreas se basa en la orientación de los electrodos y en el ventrículo donde se inyecta el ADN (lateral, tercero o cuarto). Con la estrategia descrita aquí, podemos etiquetar un número sustancial de celdas, lo que es útil para evaluar los cambios generales en la conectividad/inervación en experimentos funcionales. Sin embargo, para estudiar los cambios finos en la conectividad, se pueden utilizar versiones modificadas de la electroporación en el útero para obtener el etiquetado más escaso e identificar celdas individuales16. En resumen, la electroporación doble en el útero es un método versátil que permite apuntar temporal y espacialmente a las poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente y estudiar sus interacciones en detalle, ya sea en condiciones de control o combinadas con experimentos funcionales, reduciendo considerablemente los costos temporales y económicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El estudio de las interacciones célula-célula in vivo en regiones con alta densidad celular como la corteza cerebral es una tarea compleja. Los enfoques tradicionales, incluido el uso de anticuerpos para etiquetar las neuritas, no son adecuados debido a la falta de marcadores específicos para diferentes poblaciones celulares. El uso de modelos murino transgénicos, donde un tipo de célula particular expresa una proteína fluorescente, es útil para visualizar los procesos neuronales, pero esto depende de la disponibi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Cristina Andrés Carbonell y a los miembros de las instalaciones de Cuidado animal de la Universidad de Valencia por su asistencia técnica. También queremos agradecer a Isabel Fariñas y Sacramento R. Ferrón por los reactivos y compartir sus equipos con nosotros. I.M.W está financiado por un contrato de Garantía Juvenil de la Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D está financiado por el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz posee una Beca Ramón y Cajal (RYC-2015-19058) del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN). Esta obra fue financiada RYC-2015-19058 y SAF2017-82880-R (MICINN).
Materials
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System – 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System – Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
Referências
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