Double In Utero Elektroporation, um zeitlich und räumlich getrennte Zellpopulationen anzuvisieren
Summary
Die doppelte Utero-Elektroporation ermöglicht die Ausrichtung auf Zellpopulationen, die räumlich und zeitlich getrennt sind. Diese Technik ist nützlich, um Wechselwirkungen zwischen diesen Zellpopulationen mit fluoreszierenden Proteinen unter normalen Bedingungen, aber auch nach funktionellen Experimenten zu visualisieren, um Gene von Interesse zu stören.
Abstract
In der Utero-Elektroporation ist eine In-vivo-DNA-Transfertechnik, die ausgiebig zur Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen verwendet wird, die der Kortikogenese von Säugetieren zugrunde liegen. Dieses Verfahren nutzt die Hirnventrikel, um die Einführung von DNA von Interesse zu ermöglichen und verwendet ein Paar Von Elektroden, um den Eingang des genetischen Materials in die Zellen zu lenken, die die Herzkammer, die neuronalen Stammzellen auskundschaften. Diese Methode ermöglicht es Forschern, die gewünschten Zellen zu kennzeichnen und/oder die Expression von Genen zu manipulieren, die für diese Zellen von Interesse sind. Es hat mehrere Anwendungen, einschließlich Assays, die auf neuronale Migration, Linienverfolgung und axonale Pfadfindung abzielen. Ein wichtiges Merkmal dieser Methode ist ihre zeitliche und regionale Kontrolle, die die Umgehung potenzieller Probleme im Zusammenhang mit embryonaler Letalität oder dem Fehlen spezifischer CRE-Treibermäuse ermöglicht. Ein weiterer relevanter Aspekt dieser Technik ist, dass sie dazu beiträgt, die wirtschaftlichen und zeitlichen Einschränkungen, die die Erzeugung neuer Mauslinien beinhalten, erheblich zu reduzieren, die besonders wichtig für die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Zelltypen werden, die in entfernten Bereichen des Gehirns in unterschiedlichen Entwicklungszeiten entstehen. Hier beschreiben wir eine Doppelelektroporationsstrategie, die die Ausrichtung von Zellpopulationen ermöglicht, die räumlich und zeitlich getrennt sind. Mit diesem Ansatz können wir verschiedene Subtypen von Zellen an verschiedenen Orten mit ausgewählten fluoreszierenden Proteinen kennzeichnen, um sie zu visualisieren, und/oder wir können Gene von Interesse manipulieren, die von diesen verschiedenen Zellen zu den entsprechenden Zeiten ausgedrückt werden. Diese Strategie erhöht das Potenzial der in utero Elektroporation und bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um das Verhalten von zeitlich und räumlich getrennten Zellpopulationen zu untersuchen, die migrieren, um enge Kontakte zu knüpfen, sowie langfristige Interaktionen durch axonale Projektionen, wodurch zeitliche und wirtschaftliche Kosten reduziert werden.
Introduction
Die Großhirnrinde ist eine sehr komplexe und kompliziert organisierte Struktur. Um einen solchen Organisationsgrad zu erreichen, durchlaufen kortikale Projektionsneuronen komplexe Entwicklungsprozesse, die ihre zeitliche Generierung erfordern, die Migration zum endgültigen Bestimmungsort in der kortikalen Platte und die Etablierung von Kurz- und Langstreckenverbindungen1,2. Lange Zeit basierte die klassische Art, Die Kortikogenese zu studieren, auf der Verwendung von Knockout- oder Knock-in-Murine-Modellen von Genen von Interesse. Diese Strategie, insbesondere die Verwendung von bedingten Knockout-Mäusen, ist jedoch zeitaufwändig und teuer und wirft manchmal zusätzliche Probleme hinsichtlich der Existenz genetischer Redundanz oder des Fehlens spezifischer CRE-Treiber auf, unter anderem. Einer der Ansätze, die entstanden, um zu versuchen, diese Probleme anzugehen, und das wird heutzutage ausgiebig verwendet, um die kortikale Entwicklung zu studieren, ist in der Utero-Elektroporation3,4. In der Utero-Elektroporation ist eine Technik für die somatische Transgenese verwendet, die in vivo Targeting von neuronalen Stammzellen und ihre Nachkommen ermöglicht. Diese Methode kann verwendet werden, um Zellen durch die Expression von fluoreszierenden Proteinen5,6, für Genmanipulation in vivo (d.h. Gewinn oder Verlust von Funktionsassays)7,8,9, zur Isolierung elektropoierter Kortiken in vitro und Kultivierungszellen8,10. Darüber hinaus ermöglicht die In-Utero-Elektroporation eine zeitliche und regionale Kontrolle des Zielgebiets. Diese Technik hat zahlreiche Anwendungen und wurde weit verbreitet, um neuronale Migration zu studieren, Stammzellteilung, neuronale Konnektivität, und andere Themen8,9,11,12.
Das aktuelle Manuskript beschreibt die Verwendung einer in utero Elektroporation Variante, die als Doppelin der Utero-Elektroporation bezeichnet wird, um die Wechselwirkungen von Zellen in der Großhirnrinde mit unterschiedlichen zeitlichen und räumlichen Ursprüngen zu analysieren. Diese Studien sind äußerst komplex, wenn sie murine Modelle verwenden, da sie die kombinierte Verwendung mehrerer transgener Linien erfordern. Einige der Anwendungen des protokolls, das in diesem Papier beschrieben wird, umfassen die Untersuchung enger Wechselwirkungen zwischen benachbarten Zellen sowie Wechselwirkungen zwischen entfernten Zellen durch weiträumige Projektionen. Die Methode erfordert die Durchführung von zwei unabhängigen in utero Elektroporation Operationen, zeitlich und räumlich getrennt, auf den gleichen Embryonen, um verschiedene Zellpopulationen von Interesse zu zielen. Der Vorteil dieses Ansatzes ist die Möglichkeit, die Genfunktion in einer oder beiden Arten von Neuronen mit Wildtieren zu manipulieren. Darüber hinaus können diese funktionellen Experimente mit der Expression von zytoplasmatischen oder membrangetaggten fluoreszierenden Proteinen kombiniert werden, um die feine Morphologie von Zielzellen, einschließlich Dendriten und Axonen, zu visualisieren und mögliche Unterschiede in zellulären Wechselwirkungen im Vergleich zu einer Kontrolle zu analysieren (d. h. Zellen, die nur mit dem fluoreszierenden Protein gekennzeichnet sind).
Das hier abgegrenzte Protokoll konzentriert sich auf die Untersuchung zellulärer Wechselwirkungen innerhalb des Neocortex, aber diese Strategie könnte auch verwendet werden, um Wechselwirkungen mit extrakortikalen Bereichen zu untersuchen, die mit Hilfe der Uteroelektroporation, wie dem Subpallium oder dem Thalamus13,,14, oder Zell-Zell-Wechselwirkungen in anderen Strukturen, wie dem Kleinhirn15, gezielt betrachtet werden können. Die Ausrichtung auf verschiedene Bereiche basiert auf der Ausrichtung der Elektroden und auf dem Ventrikel, in dem die DNA injiziert wird (lateral, dritte oder vierte). Mit der hier beschriebenen Strategie können wir eine beträchtliche Anzahl von Zellen kennzeichnen, was nützlich ist, um allgemeine Veränderungen der Konnektivität/Innervation in funktionellen Experimenten zu bewerten. Dennoch, um feine Veränderungen in der Konnektivität zu untersuchen, kann man modifizierte Versionen der Utero-Elektroporation verwenden, um eine spärlichere Beschriftung zu erhalten und einzelne Zellen zu identifizieren16. Zusammenfassend ist die Doppel-Elektroporation eine vielseitige Methode, die es ermöglicht, zeitlich und räumlich getrennte Zellpopulationen anzusprechen und ihre Wechselwirkungen im Detail zu untersuchen, entweder unter Kontrollbedingungen oder in Kombination mit funktionellen Experimenten, wodurch die zeitlichen und wirtschaftlichen Kosten erheblich reduziert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Untersuchung von Zell-Zell-Wechselwirkungen in vivo in Regionen mit hoher Zelldichte wie der Großhirnrinde ist eine komplexe Aufgabe. Herkömmliche Ansätze, einschließlich der Verwendung von Antikörpern zur Kennzeichnung von Neuriten, sind nicht geeignet, da es an spezifischen Markern für verschiedene Zellpopulationen fehlt. Die Verwendung von transgenen murinen Modellen, bei denen ein bestimmter Zelltyp ein fluoreszierendes Protein ausdrückt, ist nützlich, um die neuronalen Prozesse zu visualisieren, aber die…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Cristina Andrés Carbonell und Mitgliedern der Tierpflegeeinrichtung der Universidad de Valencia für die technische Unterstützung. Wir möchten uns auch bei Isabel Fari’as und Sacramento R. Ferron für die Reagenzien und die gemeinsame Nutzung ihrer Ausrüstung mit uns bedanken. I.M.W wird durch einen Vertrag von der Conselleria de Educacion de Valencia (GJIDI/2018/A/221) finanziert, D.dA.D wird vom Ministerio de Ciencia, Innovacién y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150) finanziert. C.Gil-Sanz hält einen Ramen y Cajal Grant (RYC-2015-19058) vom spanischen Ministerio de Ciencia, Innovacién y Universidades (MICINN). Diese Arbeit wurde RYC-2015-19058 und SAF2017-82880-R (MICINN) finanziert.
Materials
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System – 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System – Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
Referências
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