Standardisierte Methoden zur Messung der Induktion der Hitzeschockreaktion bei Caenorhabditis elegans
Summary
Hier werden standardisierte Protokolle zur Beurteilung der Induktion der Wärmeschockreaktion (HSR) bei Caenorhabditis elegans mit RT-qPCR auf molekularer Ebene, fluoreszierenden Reportern auf zellulärer Ebene und Thermorecovery auf Organismusebene vorgestellt.
Abstract
Die Hitzeschock-Reaktion (HSR) ist eine zelluläre Stressreaktion, die durch zytosolische Proteinfehlfaltung induziert wird, die zur Wiederherstellung der Proteinfaltungshomöostase oder Proteostase dient. Caenorhabditis elegans nimmt eine einzigartige und leistungsfähige Nische für die HSR-Forschung ein, da die HSR auf molekularer, zellulärer und organismischer Ebene beurteilt werden kann. Daher können Veränderungen auf molekularer Ebene auf zellulärer Ebene visualisiert und ihre Auswirkungen auf die Physiologie auf der Organismusebene quantisiert werden. Während Assays zur Messung der HSR einfach sind, machen Es bei Variationen in Timing, Temperatur und Methodik, die in der Literatur beschrieben werden, schwierig, die Ergebnisse in den Studien zu vergleichen. Darüber hinaus stellen diese Fragen ein Hindernis für alle dar, die die HSR-Analyse in ihre Forschung einbeziehen möchten. Hier wird eine Reihe von Protokollen zur robusten und reproduzierbaren Messung der Induktion der HSR mit RT-qPCR, fluoreszierenden Reportern und einem organismusförmigen Thermorecovery-Assay vorgestellt. Darüber hinaus zeigen wir, dass ein weit verbreiteter Thermoverträglichkeitstest nicht vom etablierten Master-Regler der HSR, HSF-1, abhängig ist und daher nicht für die HSR-Forschung verwendet werden sollte. Schließlich werden Variationen in diesen Assays in der Literatur diskutiert und Best Practices vorgeschlagen, um die Ergebnisse auf dem gesamten Gebiet zu standardisieren und letztlich neurodegenerative Erkrankungen, Alterung und HSR-Forschung zu erleichtern.
Introduction
Die Hitzeschockreaktion (HSR) ist eine universelle zelluläre Stressreaktion, die durch zytosolische Proteinfehlfaltung verursacht wird, die durch Temperaturerhöhungen und andere proteotoxische Belastungen verursacht wird. Die Aktivierung der HSR in Caenorhabditis elegans führt zu einer transkriptionellen Upregulation von Hitzeschockgenen wie hsp-70 und hsp-16.2. Viele Hitzeschockproteine (HSPs) fungieren als molekulare Chaperone, die proteinfaltige Homöostase oder Proteostase wiederherstellen, indem sie direkt mit falsch gefalteten oder beschädigten Proteinen interagieren. Der Hauptregler der HSR ist der Transkriptionsfaktor Heat Shock Factor 1 (HSF-1), dessen Aktivierung elegant über mehrere Mechanismen gesteuert wird1.
Die Rolle von HSF-1 ist nicht auf Stress beschränkt. HSF-1 ist für normales Wachstum und Entwicklung erforderlich, da die Löschung von hsf-1 zu Larvenstillstandführt 2. HSF-1 ist auch wichtig während der Alterung und altersbedingte neurodegenerative Erkrankungen durch Ansammlung von Proteinaggregaten und die Unfähigkeit, Proteostase zu halten gekennzeichnet. Knockdown von hsf-1 verursacht Akkumulation von Proteinaggregaten und eine verkürzte Lebensdauer, während überexpression von hsf-1 die Proteinaggregation reduziert und die Lebensdauer3,4verlängert. Daher hat die Regulierung von HSF-1 auf molekularer Ebene weitreichende Auswirkungen auf die Physiologie und Krankheit des Organismus.
C. elegans ist ein mächtiger Modellorganismus für die HSR-Forschung, da die HSR auf der Molekular-, Zell- und Organismusebene4,,5,6gemessen werden kann. Unter Hervorhebung der Leistungsfähigkeit dieses Modells wurden wichtige Fortschritte bei der Abgrenzung des HSR-Signalwegs, wie gewebespezifische Unterschiede in der HSR-Regulierung, in C. elegans7,8entdeckt. Darüber hinaus ist C. elegans weit verbreitet für die Alterungsforschung und ist ein aufstrebendes System zur Modellierung von Krankheiten im Zusammenhang mit Proteostase-Störungen.
Obwohl Hitzeschock-Experimente mit C. elegans schnell und reproduzierbar sein können, gibt es mehrere Fragen, die vor Beginn zu berücksichtigen sind. Welche Temperatur sollte beispielsweise für die Induktion der HSR verwendet werden und wie lange sollten die Würmer freigelegt werden? Ist es besser, einen trockenen Inkubator oder ein Wasserbad zu verwenden? Welche Entwicklungsstufe sollte genutzt werden? Leider sind die Methoden zur Untersuchung der HSR von Labor zu Labor sehr unterschiedlich, was bei der Auswahl der besten Methoden Verwirrung stiftet und es schwierig macht, die Ergebnisse im gesamten Feld zu vergleichen.
Wir präsentieren robuste und standardisierte Protokolle für die Verwendung von RT-qPCR, fluoreszierenden Reportern und Thermorecovery zur Messung der HSR. Diese drei Ansätze ergänzen sich zwar, haben aber jeweils einzigartige Vor- und Nachteile. Zum Beispiel ist RT-qPCR die direkteste und quantitativste Messung der HSR, und dieser Test kann leicht erweitert werden, um viele verschiedene Wärmeschock-induzierbare Gene einzubeziehen. ALLERDINGS ist RT-qPCR der teuerste, kann technisch schwierig sein und erfordert den Einsatz von Spezialgeräten. Im Gegensatz dazu haben fluoreszierende Reporter den Vorteil, gewebespezifische Unterschiede in der HSR-Induktion zu messen. Sie sind jedoch schwer genau zu quantifizieren, können nur die Induktion über einer bestimmten Schwelle messen und erfordern die Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops. Zusätzlich sind die hier beschriebenen Reporterstämme im Vergleich zur Standard-N2-Sorte entwicklungsverzögert. Obwohl neuere Reporterstämme mit Single-Copy-Transgenes zur Verfügung stehen, wurden sie hier nicht getestet9. Der dritte Test, die Thermorecovery, hat den Vorteil, dass auf der Ebene des Organismus eine physiologisch relevante Auslesung erfolgt. Dieser Test ist jedoch wohl der am wenigsten empfindliche und indirekte. Schließlich diskutieren wir einige häufige Variationen, die in diesen Assays gefunden werden, und schlagen eine Reihe bewährter Verfahren vor, um die Forschung in diesem Bereich zu erleichtern.
Protocol
Representative Results
Discussion
In der Literatur wurden eine Vielzahl von Temperaturen, Zeiten und Geräten verwendet, um die HSR zu assayen, was unnötige Vorbehalte eingeführt hat und zu Schwierigkeiten beim Vergleich der Ergebnisse zwischen Laboratorien geführt hat. Zum Beispiel wurden Temperaturen zwischen 32-37 °C und Zeiten von 15 min bis mehrere Stunden verwendet, um den HSR15zu induzieren. Es wird jedoch berichtet, dass die Letalität bereits 3 h bei 37 °C für alle Stadien und 1,5 h für Erwachsene am 1. Tag15auftritt. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Exposition von Würmern bei 35 °C eine Letalität verursacht, die nicht HSF-1 abhängig ist, was diese Bedingungen für die Analyse der HSR schlecht geeignet macht. Im Gegensatz dazu ist ein Hitzeschock von 33 °C für 1 h robust genug, um eine starke Induktion von Hitzeschock-Genen auszulösen, aber mild genug, um die Wurmlebensfähigkeit nicht zu beeinträchtigen. Tatsächlich führt die Exposition gegenüber 33 °C für 6 h nur dazu, dass 20 % der Würmer eine abnormale Bewegung aufweisen. Daher schlagen wir vor, eine Temperatur von 33 °C und eine Zeit von 1 h als standardisierte Bedingung für RT-qPCR- und fluoreszierende Reporter-Assays zu verwenden.
Jüngste Experimente haben gezeigt, dass die Entwicklungsinszenierung von Würmern für HSR-Experimente besonders wichtig ist. Kürzlich wurde gezeigt, dass in C. elegans die Induzierbarkeit der HSR um >50% abnimmt (d.h. kollabiert), wenn Hermaphroditen mit der Eiablage beginnen5. Die korrekte Inszenierung der Würmer ist von entscheidender Bedeutung, da es oft Unterschiede im Entwicklungszeitpunkt in Stämmen gibt, die Mutationen tragen. Wenn temperaturempfindliche Mutanten verwendet werden, wirkt sich dies auch auf die Ergebnisse aus, wenn sie nicht durch ihr Fortpflanzungsalter synchronisiert werden. Daher wird empfohlen, den Beginn der Eiablage für jede Sorte sorgfältig zu messen, um zu bestimmen, wann der Kollaps auftritt. Das Zeitfenster nach dem L4-Molt und vor Beginn der Fortpflanzungsreife ist eng; Daher ist darauf zu achten, dass der HSR-Kollaps nicht versehentlich zu Variabilität der Ergebnisse führt.
Neben dem Entwicklungszeitpunkt können überraschend geringe Temperaturänderungen von nur 1 °C erhebliche Auswirkungen auf die HSR haben. Zum Beispiel sind thermosensorische Neuronen in C. Elegans empfindlich gegenüber Temperaturänderungen von bis zu 0,05 °C16. Daher ist es unerlässlich, ein Thermometer zu verwenden, das die Temperatur genau messen kann. Daher schlagen wir als bewährte Methode die Verwendung eines kalibrierten Geräts für die Temperaturmessung vor, das präzise genug ist, um Temperaturen innerhalb von 0,1 °C zu messen. Darüber hinaus sollte ein Thermometer mit einer Datenprotokollierungsfunktion verwendet werden, um Temperaturschwankungen über die Zeit hinweg zu messen. Viele Inkubatoren haben thermische Schwankungen von mehr als 1 °C in verschiedenen Teilen des Inkubators und im Laufe der Zeit, die erhebliche Auswirkungen auf HSR-Experimente haben können. Als bewährte Methode empfehlen wir die Verwendung von Inkubatoren mit ausreichender Isolierung und Zirkulation, um Temperaturschwankungen zu minimieren. Für die Durchführung von Hitzeschockexperimenten schlagen wir eine bewährte Praxis für ein zirkulierendes Wasserbad vor. Die Zeit, die eine Agarplatte benötigt, um eine gewünschte Temperatur zu erreichen, beträgt ca. 6-7 min in einem Wasserbad, aber viel länger in einem trockenen Inkubator15,17. Wenn jedoch kein zirkulierendes Wasserbad zur Verfügung steht, haben wir gezeigt, dass eine robuste HSR-Induktion auch in einem trockenen Inkubator unter unseren Bedingungen auftritt. Wenn ein trockener Inkubator verwendet wird, sollte das Öffnen des Inkubators für die Dauer der Spannung minimiert werden.
Es ist allgemein bekannt, dass die Induktion von Hitzeschockgenen vom Masterregulator der HSR, HSF-1, abhängt. Hier stellen wir Beweise dafür vor, dass die beiden weiteren indirekten Assays, fluoreszierende Reporter und Thermorecovery, ebenfalls von HSF-1 abhängig sind. Bezeichnenderweise fanden wir heraus, dass ein häufig verwendeter alternativer Organismus-Assay, Thermotoleranz, nicht HSF-1 abhängig ist, indem hsf-1 RNAi verwendet wird (Abbildung 4). Ähnliche Ergebnisse wurden bereits mit einem hsf-1 Mutant oder einem ttx-3 Mutant berichtet, der die HSR18,19,20blockiert. Zusammen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der Thermoverträglichkeitstest nicht für die HSR-Forschung verwendet werden sollte. Darüber hinaus deutet dies darauf hin, dass es eine bewährte Methode ist, die HSF-1-Abhängigkeit für jeden Test zu testen, der zur Messung der HSR verwendet wird.
Zusammen stellen wir eine Reihe standardisierter Protokolle und Best Practices für die robuste und reproduzierbare Messung der HSR-Induktion in C. elegansvor. Wir hoffen, dass diese Methoden die Variabilität in HSR-Experimenten verringern und die Reproduzierbarkeit erhöhen werden. Die Erleichterung direkter Vergleiche der HSR-Forschung zwischen Laboratorien wird dazu beitragen, die Forschung im HSR-Bereich zu beschleunigen. Darüber hinaus wird die Standardisierung der Erforschung von Alterungs- und neurodegenerativen Erkrankungen zugute kommen, mit denen die HSR eng verbunden ist.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch eine Spende von Frank Leslie unterstützt. Einige Stämme wurden von der CGC bereitgestellt, die vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird.
Materials
| 18S-forward primer | TTGCGTCAACTGTGGTCGTG | ||
| 18S-reverse primer | CCAACAAAAAGAACCGAAGT CCTG |
||
| AM446 rmIs223[phsp70::gfp; pRF4(rol-6(su1006))] | Morimoto lab | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/ | |
| C12C8.1-forward primer | GTACTACGTACTCATGTGTCG GTATTT |
||
| C12C8.1-reverse primer | ACGGGCTTTCCTTGTTTTCC | ||
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio Rad | 1855200 | |
| CL2070 dvIs70 [hsp-16.2p::GFP + rol-6(su1006)] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
| EasyLog Thermistor Probe Data Logger with LCD | Lascar | EL-USB-TP-LCD | |
| Greenough Stereo Microscope S9i Series | Leica | ||
| Hard Shell 96 Well PCR Plates | Bio Rad | HSS9601 | |
| hsp-16.2-forward primer | ACTTTACCACTATTTCCGTCC AGC |
||
| hsp-16.2-reverse primer | CCTTGAACCGCTTCTTTCTTTG | ||
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio Rad | 1708891 | |
| iTaq Universal Sybr Green Super Mix | Bio Rad | 1725121 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | Eclipse 90i | |
| MultiGene OptiMax Thermo Cycler | Labnet | TC9610 | |
| N2 (WT) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
| Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-LITE | |
| Parafilm M Roll | Bemis | 5259-04LC | |
| RapidOut DNA Removal Kit | Thermo Scientific | K2981 | |
| Recirculating Heated Water Bath | Lauda Brinkmann | RE-206 | |
| Traceable Platinum Ultra-Accurate Digital Thermometer | Fisher Scientific | 15-081-103 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation reagent |
| TurboMix Attachment | Scientific Industries | SI-0564 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 |
Referências
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