卡诺哈布迪蒂斯精英热休克反应的测量诱导标准化方法

1. C. elegans 的维护和同步 保持蠕虫在20°C的线虫生长介质（NGM）板种子与OP50埃舍里切亚大肠杆菌通过转移几个成年人到新鲜板约每周2次10。应注意防止蠕虫耗尽食物，因为这会影响它们的生理。 准备NGM板。 混合 3 g NaCl， 2.5 g 的巴托 -佩酮， 20 g 的阿加， 和去电化 （DI） H2O 高达 1 L 在烧瓶中。 将混合物灭菌。 让混合物冷却至+50°C。 加入 25 m L 1 M KH2PO4 （pH = 6），1 m CaCl2 的1 mL，1 m MgSO4的 1 mL，以及 1 mL 的胆固醇（100% 乙醇中的 5 mg/mL）。 使用无菌技术，将混合物倒入 6 厘米板中，产生大约 100 个板。如果首先将混合物转移到 300 mL 无菌烧杯中，浇注板更容易。 在用细菌播种或储存在4°C之前，在室温（RT）下留出1天凝固。 将OP50细菌播种到NGM板上。 在 30°C 或 37 °C 下在 LB 中生长饱和的隔夜 OP50 细菌培养。 将大约 300 μL 的培养点放在 6 厘米 NGM 板的中心。 让板在RT干燥1-3天，根据需要细菌草坪坚持在板。然后，板可以在4°C下使用或储存。 通过分离新鲜产卵（此处描述），或者通过用漂白剂溶解蠕虫后收集卵子，同步生长蠕虫。 使用铂线采摘将大约 10 只格拉维德成年蠕虫转移到新鲜盘子中。如果成年人在成年的第一天，产卵同步效果最好。 大约 1 个月后，从板上取下蠕虫。这应该导致40-60鸡蛋每板，这取决于条件和应变。 2. HSR记者的荧光成像 同步蠕虫（第 1.2 节），并保持在 20°C，直到所需的发育阶段。对于 AM446 （hsp-70p：：：gfp） 和 CL2070 （hsp-16.2p：：gfp） 荧光报告器菌株，尚未达到生殖成熟度的年轻成年蠕虫在产卵同步后 64 小时生成。注：发育时间随各菌株和蠕虫的升高温度而变化。与 N2 相比，两个 HSR 报告器菌株都表现出轻微的发育延迟。重要的是，在生殖成熟期开始之后，HSR诱导的幅度大约下降2-4倍（见讨论）。 热击蠕虫，用石蜡膜包裹板，在33°C的循环水浴中淹没1小时。薄条石蜡薄膜应包裹2倍围绕板密封的边缘。不要盖住板的底部，否则可能会干扰传热。使用试管机架和铅重倒置板。如有必要，请记住包括阴性控制样品（无热冲击）。注：如果石蜡膜不安全，则水将进入板，不应用于数据收集。 通过从水浴中取下盘子并用纸巾干燥来回收蠕虫。取出石蜡膜，在20°C下孵育蠕虫6-24小时。此恢复期允许有充足的时间进行 GFP 合成和折叠，然后再进行成像。 准备用于成像的幻灯片。幻灯片应为每次使用准备新鲜。 在水和热中用微波炉制作 3% 的气糖溶液，直到水加糖溶解。 将显微镜幻灯片放在另外两张显微镜幻灯片之间进行成像，这些幻灯片上有一条实验室胶带，为 agarose 垫创建一个垫片。 使用 1，000 μL 移液器，将加热的 3% 气糖滴到显微镜幻灯片的中心。 立即用垂直于第一张幻灯片的空白显微镜幻灯片覆盖显微镜幻灯片，使顶部幻灯片位于相邻幻灯片上的实验室胶带上。这会展开阿加罗斯的掉落，以创建一个均匀宽度的垫。 小心地拆下顶部幻灯片。 使用 200 μL 移液器将 M9 缓冲液中 1 mM levamisole 的小滴（±5 μL）添加到 agarose 垫的中心，使蠕虫固定。然后使用铂线挑将 10 个蠕虫转移到莱瓦米索滴中。盖上盖板。对于直立显微镜，不需要密封盖玻片。可选地，蠕虫在瘫痪时可以对齐，将利加米索摊开，传播到阿加罗斯垫的外端，并使蠕虫与铂丝挑对齐。或者，使用实验室湿巾可以浸泡利瓦米索。注：尽快成像，因为长时间在利法米底孵育可能会改变荧光。 使用荧光显微镜对蠕虫进行成像。图像捕获的细节因显微镜和软件而异。注：要直接比较图像强度，请在一个成像会话中使用相同的显微镜设置。避免过度饱和图像。 3. 使用RT-qPCR测量HSR基因表达 同步蠕虫（第 1.2 节），并保持在 20°C，直到所需的发育阶段。对于N2蠕虫，尚未达到生殖成熟度的年轻成年蠕虫在产卵同步后60小时生成。注：发育时间随各菌株和蠕虫的升高温度而变化。重要的是，在生殖成熟期开始之后，HSR诱导的幅度大约下降2-4倍（见讨论）。 如步骤 2.2 所述的热冲击蠕虫。 将盘子从水浴中取出，取出石蜡膜，并立即收集蠕虫。通过用1 mL的M9轻轻清洗板，将液体收集在微离心管中，然后在400 x g的离心后去除M91分钟，可以收集蠕虫。 使用有机萃取物对蠕虫进行精化和纯化RNA。 加入250μL的RNA分离试剂（参见材料表）。 旋涡管用手30 s。 使用微离心管附件在 4 °C 下 20 分钟的涡流管（参见材料表）。 加入50μL的氯仿。 30 s 的漩涡。 在RT中孵育样品3分钟。 在 +14，000 x g 下离心15 分钟，在 4 °C 下。 将水层（即顶层，±125 μL）转移到新的微离心管中。注：避免在界面中的有机层和材料。 加入50μL的氯仿。 30 s 的漩涡。 在RT中孵育样品3分钟。 在 +14，000 x g 下离心5 分钟，在 4 °C 下。 将水层（±100 μL）转移到新的微离心管中。注：避免在界面中的有机层和材料。 以等量（即100μL）的异丙醇沉淀RNA。 在-20°C下孵育至少30分钟，但最好过夜。注：实验可以在这里暂停，RNA可以储存在-20°C。 在 +14，000 x g 下离心，在 4 °C下以 ±30 分钟将RNA切自。 在不干扰颗粒的情况下，尽可能多地去除上一液。注：颗粒很小，可能不可见。颗粒可能不会紧贴在管子的一侧，因此必须小心避免将颗粒开走。 用 250 μL 的 70% 冰冷乙醇用无 RNase H 2 O 制备的颗粒进行清洗。 在 +14，000 x g 下离心，在 4 °C 下为 ±5 分钟。 在不干扰颗粒的情况下，尽可能多地去除上一除。 在RT上快速旋转，去除剩余的70%乙醇。 根据需要，让管子在RT处打开，使颗粒干燥;通常至少20分钟，管子可以覆盖一个无绒组织或铝箔，以防止污染。 将颗粒在 20 μL 无 RNase H2O 中重新释放。 使用小体积分光光度计（2 μL）确定RNA浓度。注：实验可以在这里暂停，RNA可以暂时储存在-20°C或以下。 使用DNase I孵育去除残留DNA。建议使用市售套件（参见材料表），并遵循制造商的说明。 使用该试剂盒，在 37°C 水浴中，用 500 ng 的 RNA 和 1 μL 的 DNase I 制备 20 μL 反应，使用 30 分钟。 将 2.5 μL 的 DNase 灭活试剂（包含在试剂盒中）添加到每个样品中，并在 RT 中孵育 5 分钟，偶尔进行轻拂/涡旋。 以 14，000 x g 向下旋转 2 分钟。 在不干扰白色颗粒的情况下，将15μL的上清液转移到用于cDNA合成的新鲜微管中。 进行cDNA合成。建议使用市售套件（参见材料表），并遵循制造商的说明。 使用该试剂盒，制备 20 μL 反应，使用上一步处理的 15 μL RNA 和 1 μL 的逆转录酶。 使用以下程序进行cDNA合成：25°C 5分钟，46°C20分钟，95°C为1分钟，4°C保持。 通过将 80 μL 无 RNase H2O 直接添加到样品中稀释 cDNA。 短暂涡流，然后旋转并储存在-20°C，直到需要。 执行 qPCR。建议使用市售套件（参见材料表），并遵循制造商的说明。 使用该套件，在 96 井板的一个井中制备含有 2 μL cDNA 和 200 nM（每个）的前进和反向底转的 25 μL 反应。 用于测量热冲击基因的底基因，hsp-70和hsp-16.2，以及18S rRNA（用于规范化控制）列在材料表中。可根据需要使用多个规范化控件。 在测量 18S 之前稀释 cDNA 样品50 倍，以确保测定在线性范围内。适当的 qPCR 条件因使用的套件和底件而异（参见代表性结果）。 对于 qPCR 使用实时 PCR 检测系统（参见材料表），qPCR 的周期为 40 个周期，5°C 为 5 s 变性，58 °C 为 30 s 退火，72 °C 用于 30 s 扩展。注：最佳退火温度可能因底向和条件而异。 使用 +Ct 或标准曲线方法12 进行量化。 4. 在有机体一级测量HSR的特高覆盖测定 同步蠕虫（第 1.2 节），并保持在 20°C，直到所需的发育阶段。对于N2蠕虫，尚未达到生殖成熟度的年轻成年蠕虫在产卵同步后60小时生成。注：发育时间随各菌株和蠕虫的升高温度而变化。重要的是，在生殖成熟期开始之后，HSR诱导的幅度大约下降2-4倍（见讨论）。 热击蠕虫，如步骤2.2所述6小时。 从水浴中取下盘子，取出石蜡膜，让蠕虫在20°C下孵育48小时。 计算在机械刺激后可以立即爬走的蠕虫数量，而不会发生抖动或瘫痪。注：6小时孵育是检查减少覆盖条件的最佳方法，但可能需要更长的暴露时间来寻找增强功能覆盖的条件。