Untersuchung des Xenobiotika-Stoffwechsels in Salix alba-Blättern mittels Massenspektrometrie-Bildgebung
Summary
Diese Methode verwendet massenspektrometrische Bildgebung (MSI), um Stoffwechselprozesse in S. alba-Blättern zu verstehen, wenn sie Xenobiotika ausgesetzt sind. Die Methode ermöglicht die räumliche Lokalisierung von interessierenden Verbindungen und ihren vorhergesagten Metaboliten in spezifischen, intakten Geweben.
Abstract
Die vorgestellte Methode verwendet massenspektrometrische Bildgebung (MSI), um das metabolische Profil von S. alba-Blättern zu bestimmen, wenn sie Xenobiotika ausgesetzt sind. Mit einem nicht zielgerichteten Ansatz werden Pflanzenmetaboliten und Xenobiotika von Interesse identifiziert und in Pflanzengeweben lokalisiert, um spezifische Verteilungsmuster aufzudecken. Anschließend wird eine in silico Vorhersage potenzieller Metaboliten (d.h. Katabolite und Konjugate) aus den identifizierten Xenobiotika durchgeführt. Wenn sich ein xenobiotischer Metabolit im Gewebe befindet, wird die Art des Enzyms aufgezeichnet, das an seiner Veränderung durch die Pflanze beteiligt ist. Diese Ergebnisse wurden verwendet, um verschiedene Arten von biologischen Reaktionen zu beschreiben, die in S. alba-Blättern als Reaktion auf xenobiotische Ansammlung in den Blättern auftreten. Die Metaboliten wurden in zwei Generationen vorhergesagt, was die Dokumentation aufeinanderfolgender biologischer Reaktionen zur Umwandlung von Xenobiotika im Blattgewebe ermöglichte.
Introduction
Xenobiotika sind aufgrund menschlicher Aktivitäten auf der ganzen Welt weit verbreitet. Einige dieser Verbindungen sind wasserlöslich und werden vom Boden1absorbiert und gelangen in die Nahrungskette, wenn sie sich in Pflanzengewebenanreichern 2,3,4. Die Pflanzen werden von Insekten und Pflanzenfressern gefressen, die anderen Organismen zum Opfer stehen. Die Einnahme einiger Xenobiotika und ihre Auswirkungen auf die Gesundheit einer Pflanze wurdenbeschrieben 5,6,7,8, aber erst kürzlich auf Gewebeebene9. Daher ist noch unklar, wo oder wie der Stoffwechsel von Xenobiotika auftritt oder ob bestimmte Pflanzenmetaboliten mit der xenobiotischen Akkumulation in bestimmten Geweben korrelieren10. Darüber hinaus haben die meisten Forschungen den Stoffwechsel von Xenobiotika und ihren Metaboliten in Pflanzen übersehen, so dass wenig über diese Reaktionen in Pflanzengewebe bekannt ist.
Hier wird eine Methode zur Untersuchung enzymatischer Reaktionen in biologischen Proben vorgeschlagen, die mit der Gewebelokalisation von Substraten und Produkten der Reaktionen in Verbindung gebracht werden können. Die Methode kann das vollständige Stoffwechselprofil einer biologischen Probe in einem Experiment zeichnen, da die Analyse nicht zielgerichtet ist und mit benutzerdefinierten Listen von Analyten von Interesse untersucht werden kann. Bereitgestellt wird eine Liste der Kandidaten, die im ursprünglichen Datensatz verfolgt wurden. Werden in der Probe ein oder mehrere interessierende Analyten notiert, kann die spezifische Gewebelokalisation wichtige Informationen über die damit verbundenen biologischen Prozesse liefern. Die interessierenden Analyten können dann in silico unter Verwendung relevanter biologischer Gesetze modifiziert werden, um nach möglichen Produkten/Metaboliten zu suchen. Die Liste der erhaltenen Metaboliten wird dann verwendet, um die ursprünglichen Daten zu analysieren, indem die beteiligten Enzyme identifiziert und die Reaktionen in den Geweben lokalisiert werden, um so die auftretenden Stoffwechselprozesse zu verstehen. Keine andere Methode liefert Informationen über die Arten von Reaktionen, die in den biologischen Proben auftreten, die Lokalisation der interessierenden Verbindungen und ihre verwandten Metaboliten. Diese Methode kann auf jeder Art von biologischem Material angewendet werden, sobald frisches und intaktes Gewebe verfügbar ist und die interessierenden Verbindungen ionisiert werden können. Das vorgeschlagene Protokoll wurde in Villette et al.12 veröffentlicht und ist hier für die Verwendung durch die wissenschaftliche Gemeinschaft detailliert beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der kritische Teil dieses Protokolls ist die Probenvorbereitung: Die Probe muss weich und intakt sein. Das Schneiden ist der schwierigste Teil, da die Temperatur und Dicke der Probe je nach Art der untersuchten Probe variieren kann. Tierische Gewebe sind in der Regel homogen und leichter zu schneiden. Pflanzenproben enthalten oft unterschiedliche Strukturen und sind daher schwieriger intakt zu halten, da die Klinge auf weiches, hartes oder leeres Gefäßgewebe trifft. Es wird dringend empfohlen, bei der Arbeit mit Pflanz…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Charles Pineau, Mélanie Lagarrigue und Régis Lavigne für ihre Tipps und Tricks zur Probenvorbereitung für die MALDI-Bildgebung von Pflanzenproben.
Materials
| Cover slips | Bruker Daltonics | 267942 | |
| Cryomicrotome | Thermo Scientific | ||
| Excel | Microsoft corporation | ||
| flexImaging | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl | Bruker Daltonics | ||
| GTX primescan | GX Microscopes | ||
| HCCA MALDI matrix | Bruker Daltonics | 8201344 | |
| ImagePrep | Bruker Daltonics | ||
| ITO-coated slides | Bruker Daltonics | 237001 | |
| M1-embedding matrix | ThermoScientific | 1310 | |
| Metabolite Predict | Bruker Daltonics | ||
| Metaboscape | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemicals | No specific reference needed | |
| MX 35 Ultra blades | Thermo Scientific | 15835682 | |
| Plastic molds | No specific reference needed | ||
| SCiLS Lab | Bruker Daltonics | ||
| SolariX XR 7Tesla | Bruker Daltonics | The method proposed is not limited to this instrument | |
| Spray sheets for ImagePrep | Bruker Daltonics | 8261614 | |
| TFA | Sigma Aldrich | No specific reference needed |
Referências
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