Investigação do metabolismo xenobióticos em folhas de Salix alba via Imagem de Espectrometria de Massa
Summary
Este método usa imagens de espectrometria de massa (MSI) para entender processos metabólicos nas folhas de S. alba quando expostos a xenobióticos. O método permite a localização espacial de compostos de interesse e seus metabólitos previstos dentro de tecidos específicos e intactos.
Abstract
O método apresentado utiliza imagens de espectrometria de massa (IM) para estabelecer o perfil metabólico das folhas de S. alba quando expostas a xenobióticos. Usando uma abordagem não direcionada, metabólitos vegetais e xenobióticos de interesse são identificados e localizados em tecidos vegetais para descobrir padrões específicos de distribuição. Em seguida, na previsão silico de metabólitos potenciais (ou seja, catabólitos e conjugados) dos xenobióticos identificados é realizada. Quando um metabólito xenobiótico está localizado no tecido, o tipo de enzima envolvida em sua alteração pela planta é registrado. Esses resultados foram utilizados para descrever diferentes tipos de reações biológicas ocorridas nas folhas de S. alba em resposta ao acúmulo xenobiótico nas folhas. Os metabólitos foram previstos em duas gerações, permitindo a documentação de sucessivas reações biológicas para transformar xenobióticos nos tecidos da folha.
Introduction
Xenobióticos são amplamente distribuídos ao redor do mundo devido às atividades humanas. Alguns desses compostos são solúveis em água e absorvidos pelo solo1, e entram na cadeia alimentar quando se acumulam em tecidos vegetais2,3,4. As plantas são comidas por insetos e herbívoros, que são presas de outros organismos. A ingestão de alguns xenobióticos e seu impacto na saúde de uma planta foram descritos5,6,7,8, mas apenas recentemente em um nível de tecido9. Portanto, ainda não está claro onde ou como o metabolismo dos xenobióticos ocorre, ou se metabólitos vegetais específicos estão correlacionados ao acúmulo xenobiótico em tecidos específicos10. Além disso, a maioria das pesquisas tem negligenciado o metabolismo dos xenobióticos e seus metabólitos nas plantas, tão pouco se sabe sobre essas reações nos tecidos vegetais.
Proposto aqui é um método para investigar reações enzimáticas em amostras biológicas que podem estar associadas à localização tecidual de substratos e produtos das reações. O método pode desenhar o perfil metabólico completo de uma amostra biológica em um experimento, uma vez que a análise não é direcionada e pode ser investigada usando listas personalizadas de analitos de interesse. Desde que seja uma lista de candidatos rastreados no conjunto de dados original. Se um ou vários analitos de interesse forem observados na amostra, a localização específica do tecido pode fornecer informações importantes sobre os processos biológicos relacionados. Os analitos de interesse podem então ser modificados em sílico usando leis biológicas relevantes para a busca de possíveis produtos/metabólitos. A lista de metabólitos obtidos é então utilizada para analisar os dados originais, identificando as enzimas envolvidas e localizando as reações nos tecidos, ajudando assim a compreender os processos metabólicos que ocorrem. Nenhum outro método fornece informações sobre os tipos de reações ocorridas nas amostras biológicas, a localização dos compostos de interesse e seus metabólitos relacionados. Este método pode ser usado em qualquer tipo de material biológico uma vez que tecidos frescos e intactos estão disponíveis e os compostos de interesse podem ser ionizados. O protocolo proposto foi publicado em Villette et al.12 e é detalhado aqui para uso da comunidade científica.
Protocol
Representative Results
Discussion
A parte crítica deste protocolo é a preparação da amostra: a amostra deve ser macia e intacta. O corte é a parte mais difícil, pois a temperatura e a espessura da amostra podem variar dependendo do tipo de amostra estudada. Os tecidos animais são geralmente homogêneos e mais fáceis de cortar. As amostras de plantas geralmente incorporam estruturas diferentes e, portanto, são mais difíceis de manter intactas à medida que a lâmina encontra tecidos vasculares macios, duros ou vazios. É altamente recomendável …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Charles Pineau, Mélanie Lagarrigue e Régis Lavigne por suas dicas e truques sobre a preparação de amostras para a imagem MALDI de amostras de plantas.
Materials
| Cover slips | Bruker Daltonics | 267942 | |
| Cryomicrotome | Thermo Scientific | ||
| Excel | Microsoft corporation | ||
| flexImaging | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl | Bruker Daltonics | ||
| GTX primescan | GX Microscopes | ||
| HCCA MALDI matrix | Bruker Daltonics | 8201344 | |
| ImagePrep | Bruker Daltonics | ||
| ITO-coated slides | Bruker Daltonics | 237001 | |
| M1-embedding matrix | ThermoScientific | 1310 | |
| Metabolite Predict | Bruker Daltonics | ||
| Metaboscape | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemicals | No specific reference needed | |
| MX 35 Ultra blades | Thermo Scientific | 15835682 | |
| Plastic molds | No specific reference needed | ||
| SCiLS Lab | Bruker Daltonics | ||
| SolariX XR 7Tesla | Bruker Daltonics | The method proposed is not limited to this instrument | |
| Spray sheets for ImagePrep | Bruker Daltonics | 8261614 | |
| TFA | Sigma Aldrich | No specific reference needed |
Referências
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