Investigación Del Metabolismo De Xenobióticos En Hojas De Salix alba A Través De Imágenes Espectrometría De Masas
Summary
Este método utiliza imágenes de espectrometría de masas (MSI) para comprender los procesos metabólicos en las hojas de S. alba cuando se exponen a xenobióticos. El método permite la localización espacial de compuestos de interés y sus metabolitos predichos dentro de tejidos específicos e intactos.
Abstract
El método presentado utiliza imágenes de espectrometría de masas (MSI) para establecer el perfil metabólico de las hojas de S. alba cuando se exponen a xenobióticos. Utilizando un enfoque no dirigido, los metabolitos de las plantas y los xenobióticos de interés se identifican y localizan en los tejidos de las plantas para descubrir patrones de distribución específicos. A continuación, se realiza una predicción in silico de metabolitos potenciales (es decir, catabolitos y conjugados) a partir de los xenobióticos identificados. Cuando se localiza un metabolito xenobiótico en el tejido, se registra el tipo de enzima implicada en su alteración por la planta. Estos resultados se utilizaron para describir diferentes tipos de reacciones biológicas que ocurren en las hojas de S. alba en respuesta a la acumulación xenobiótica en las hojas. Los metabolitos se predijeron en dos generaciones, permitiendo la documentación de reacciones biológicas sucesivas para transformar xenobióticos en los tejidos foliares.
Introduction
Los xenobióticos están ampliamente distribuidos en todo el mundo debido a las actividades humanas. Algunos de estos compuestos son solubles en agua y absorbidos por el suelo1,y entran en la cadena alimentaria cuando se acumulan en los tejidos vegetales2,3,4. Las plantas son devoradas por insectos y herbívoros, que son presa de otros organismos. La ingesta de algunos xenobióticos y su impacto en la salud de una planta se han descrito5,6,7,8,pero sólo recientemente a nivel tisular9. Por lo tanto, todavía no está claro dónde o cómo se produce el metabolismo de los xenobióticos, o si los metabolitos específicos de las plantas están correlacionados con la acumulación xenobiótica en tejidos específicos10. Por otra parte, la mayoría de la investigación ha pasado por alto el metabolismo de los xenobióticos y sus metabolitos en las plantas, por lo que poco se sabe acerca de estas reacciones en los tejidos de las plantas.
Aquí se propone un método para investigar reacciones enzimáticas en muestras biológicas que pueden estar asociadas a la localización tisular de sustratos y productos de las reacciones. El método puede dibujar el perfil metabólico completo de una muestra biológica en un experimento, ya que el análisis no está dirigido y se puede investigar utilizando listas personalizadas de analitos de interés. Se proporciona una lista de candidatos con seguimiento en el conjunto de datos original. Si uno o varios analitos de interés se observan en la muestra, la localización específica del tejido puede proporcionar información importante sobre los procesos biológicos relacionados. Los analitos de interés pueden ser modificados in silico utilizando las leyes biológicas pertinentes para buscar posibles productos/metabolitos. La lista de metabolitos obtenidos se utiliza para analizar los datos originales mediante la identificación de las enzimas implicadas y la localización de las reacciones en los tejidos, ayudando así a comprender los procesos metabólicos que ocurren. Ningún otro método proporciona información sobre los tipos de reacciones que ocurren en las muestras biológicas, la localización de los compuestos de interés y sus metabolitos relacionados. Este método se puede utilizar en cualquier tipo de material biológico una vez que los tejidos frescos e intactos están disponibles y los compuestos de interés pueden ser ionizados. El protocolo propuesto fue publicado en Villette et al.12 y se detalla aquí para su uso por la comunidad científica.
Protocol
Representative Results
Discussion
La parte crítica de este protocolo es la preparación de la muestra: la muestra debe ser suave e intacta. El corte es la parte más difícil, ya que la temperatura y el espesor de la muestra pueden variar dependiendo del tipo de muestra estudiada. Los tejidos animales suelen ser homogéneos y más fáciles de cortar. Las muestras de plantas a menudo incorporan diferentes estructuras y, por lo tanto, son más difíciles de mantener intactas, ya que la hoja encuentra tejidos vasculares blandos, duros o vacíos. Es muy rec…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Charles Pineau, Mélanie Lagarrigue y Régis Lavigne por sus consejos y trucos con respecto a la preparación de muestras para imágenes MALDI de muestras de plantas.
Materials
| Cover slips | Bruker Daltonics | 267942 | |
| Cryomicrotome | Thermo Scientific | ||
| Excel | Microsoft corporation | ||
| flexImaging | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl | Bruker Daltonics | ||
| GTX primescan | GX Microscopes | ||
| HCCA MALDI matrix | Bruker Daltonics | 8201344 | |
| ImagePrep | Bruker Daltonics | ||
| ITO-coated slides | Bruker Daltonics | 237001 | |
| M1-embedding matrix | ThermoScientific | 1310 | |
| Metabolite Predict | Bruker Daltonics | ||
| Metaboscape | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemicals | No specific reference needed | |
| MX 35 Ultra blades | Thermo Scientific | 15835682 | |
| Plastic molds | No specific reference needed | ||
| SCiLS Lab | Bruker Daltonics | ||
| SolariX XR 7Tesla | Bruker Daltonics | The method proposed is not limited to this instrument | |
| Spray sheets for ImagePrep | Bruker Daltonics | 8261614 | |
| TFA | Sigma Aldrich | No specific reference needed |
Referências
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