Sobreexpresión retroviral de CXCR4 en células murinas B-1a y transferencia adoptiva para la migración celular B-1a dirigida a la médula ósea y la producción de IgM

Estudios recientes han demostrado células inmunitarias considerables, y específicamente células B, heterogeneidad fenotípica y funcional dependiendo de la localización celular^1,2,3,4,5. Las células B-1a son una de esas poblaciones con capacidad heterogénea para producir anticuerpos IgM protectores; Las células B-1a de la médula ósea secretan IgM de forma constitutiva y contribuyen significativamente a los títulos de Plasma IgM^6,mientras que las células peritoneales B-1a tienen secreción IgM de bajo nivel en homeostasis y en su lugar se pueden activar a través de receptores innatos similares a peajes (TLR) o señalización mediada con citoquinas para proliferar, migrar y secretar rápidamente IgM^7,8,9,10. Los anticuerpos IgM de células B-1a reconocen epítopos específicos de la oxidación (OSE) que están presentes en patógenos, células apoptóticas y LDL oxidado, y la unión igM a OSE puede prevenir la señalización inflamatoria aguas abajo en enfermedades como la aterosclerosis¹¹. Por lo tanto, las estrategias para aumentar la producción de IgM a través del aumento de la migración celular peritoneal B-1a a sitios como la médula ósea pueden ser terapéuticamente útiles. Sin embargo, es importante que tales estrategias sean dirigidas y específicas de tipo celular, ya que los efectos fuera del objetivo pueden afectar negativamente la función inmune o la salud.

Aquí describimos un método para la sobreexpresión dirigida y a largo plazo de CXCR4 en células B-1a murinas primarias y posterior transferencia adoptiva para visualizar la migración celular y la producción funcional de anticuerpos IgM (Figura 1). La manipulación genética de las células B primarias está limitada por una baja eficiencia de transfección en comparación con la transfección de líneas celulares transformadas. Sin embargo, como las líneas celulares transformadas pueden desviarse significativamente de las celdas primarias^12,,13, es probable que el uso de células primarias proporcione resultados que se alineen más estrechamente con la fisiología normal. Se han descrito varias técnicas para la transferencia de genes en células B murinas primarias, incluyendo transducción retroviral, transducción adenoviral, lipofección o transfección basada en electroporación, que tienen diferentes niveles de eficiencia, transiencia e impacto en la salud celular^13,,14,,15. El siguiente método utilizó la transducción retroviral, ya que produjo una eficiencia adecuada de transferencia de genes de >30%, mientras que afectaba mínimamente a la viabilidad celular. El retrovirus expresivo de CXCR4 se generó utilizando la proteína fluorescente verde verde de entrada de células madre murinas de construcción retroviral anteriormente descrita anteriormente (MSCV-IRES-GFP; MigR1)¹⁶, en el que el gen del ratón CXCR4 fue sub-clonado⁴. Las partículas retrovirales MigR1 (control(Ctl)-GFP) y CXCR4-GFP se generaron utilizando la transfección de fosfato cálcico como se describe en los protocolos publicados anteriormente^4,,14.

Las células B-1a transducidas con éxito se transfirieron por vía intravenosa a ratones Rag1^-/- con deficiencia de linfocitos. Tanto los ratones donantes como los receptores contenían además la noción del gen Apolipoproteína E (ApoE), lo que resulta en una mayor acumulación de OSE y aterosclerosis, proporcionando así un modelo para la activación celular in vivo B-1 y la producción de IgM. Además, los ratones donantes y receptores diferían en el alostipo CD45; las células de donante B-1 provenían de ratones CD45.1+ ApoE^-/- y se transfirieron a receptores Rag1^-/- CD45.2+ ApoE^-/-. Esto permitió la diferenciación del donante CD45.1 de las células CD45.2 B receptoras después de la transferencia sin la necesidad de manchar adicionalmente para los marcadores de células B durante el análisis de citometría de flujo. Los resultados proporcionados aquí demuestran que la sobreexpresión de CXCR4 dirigida en células B-1a se asocia con una mayor capacidad de las células B-1a para migrar a la médula ósea, que se asocia con el aumento del plasma anti-OSE IgM. Además, proporcionamos un método para el enriquecimiento de células B-1 peritoneales a través de la selección negativa y demostramos el requisito de activación de la célula B-1 para la transducción eficiente. Este método se puede adaptar para otras construcciones retrovirales para estudiar el efecto de la sobreexpresión de proteínas en la migración celular B-1a, fenotipo o función. Además, el uso de la distinción de alotipo CD45.1 frente a CD45.2 teóricamente podría permitir la transferencia a otros modelos murinos inmunes y suficientes que contengan células B endógenas.