Retroviral ביטוי יתר של CXCR4 על מורנה ב-1a תאים והעברה המאמצת עבור B-1a תא הגירה במח העצם ו IgM הפקה
Summary
כאן אנו מתארים שיטה של הבעה overexpression והעברה המאמצת של תאים מורנין ב-1a כדי לבחון ב vivo B-1a תא הגירה ולוקליזציה. פרוטוקול זה ניתן להארכה עבור שונים הזרם התפקודי של המטה אומר כולל כימות של לוקליזציה של התורם B-1a או ניתוח של הגורמים הנגזרים לתא התורם הנגזר לאחר העברה המאמצת.
Abstract
כאשר פונקציית התא מושפעת מגורמים ספציפיים לנישה בסביבת מיקרו-הסביבה הסלולרית, שיטות לנתח את הלוקליזציה של תאים והגירה יכולות לספק תובנה נוספת בנוגע לתפקוד התא. התאים b-1a הם קבוצת משנה ייחודית של תא B בעכברים לייצר נוגדנים IgM טבעי המגן נגד האפיסקופים ספציפיים חמצון הנובעים במהלך בריאות ומחלות. B-1a הייצור של תא IgM משתנה בהתאם למיקום התא B-1a, ולכן הוא הופך להיות שימושי מבחינה טיפולית כדי למקד את B-1a לוקליזציה לתמיכה נישות של ייצור נוגדנים גבוהה. כאן אנו מתארים שיטה למקד את ה-B-1a תא הגירה מח העצם על ידי retroviral-ביטוי overexpression של C-X-C מוטיב קולטן כימוקין 4 (CXCR4). האינדוקציה ג’ין בתאי murine הראשי B יכול להיות מאתגר ובדרך כלל לתשואות יעילות החצייה נמוכה של 10-20% בהתאם לטכניקה. כאן אנו מדגימים כי התמרה ויראלי של התאים הראשוניים B-1a התוצאות 30-40% יעילות התמרה. שיטה זו מנצלת העברת תאים המאמצת של תאים B-1a לתוך עכבר לקוי של הנמען תא כדי להפוך את העברת התאים של התורם B-1a ולוקליזציה ניתן לדמיין. פרוטוקול זה יכול להיות שונה עבור מבנים retroviral יעיל אחרים ניתן להשתמש בתוך מגוון פונקציונלי שלאחר העברה המאמצת, כולל ניתוח של תא התורם או המחשב המארח של תאים ותפקוד, או ניתוח של גורמים מסיסים מופרש post B-1a העברת תאים. השימוש של תורמים ועכברים הנמען ברורים הבדיל על-ידי CD 45.1 ו-CD 45.2 allotype ואת הנוכחות של עיתונאי GFP בתוך הפלסטלינה הretroviral יעיל אמצע יכול גם לאפשר זיהוי של תאים תורמים אחרים, החיסונית מספיק מודלים של העכבר המכיל את אוכלוסיית התאים האנדוגניים B.
Introduction
מחקרים שנעשו לאחרונה הפגינו תא החיסון ניכר, ובמיוחד B תא, פנוטיic ו טרוגניות פונקציונלי בהתאם לוקליזציה של התא1,2,3,4,5. B-1a תאים הם אחד כזה אוכלוסיה עם יכולת הטרוגנית לייצר נוגדנים IgM מגן; מח עצם B-1a תאים להפריש באופן קונסטיטוטיבי ולתרום בצורה משמעותית את מגדל פלזמה מטרים6, בעוד בתאי הצפק B-1a יש ברמה נמוכה igm הפרשה ב הומאוסטזיס ובמקום זאת ניתן להפעיל דרך קולטן מולדים שיחת כמו (tlr) או cytokine בתיווך איתות כדי להתרבות במהירות, להעביר, ו להפריש igm7,8,9,10. B-1a בתאי IgM לזהות אפיסקופים ספציפיים לחמצון (OSE) הנמצאים על פתוגנים, תאים אפוטוטיים, ו-LDL תחמוצת, ו-IgM קשירה כדי OSE יכול למנוע דלקת במורד הזרם מחלות כמו טרשת עורקים11. לכן, אסטרטגיות כדי להגדיל את ייצור IgM באמצעות הגדלת הצפק B-1a תא הגירה לאתרים כמו מח העצם עשוי להיות שימושי מבחינה רפואית. עם זאת, חשוב עבור אסטרטגיות כאלה כדי להיות ממוקד ותא סוג ספציפי, כמו תופעות מחוץ ליעד עלול להשפיע באופן שלילי על תפקוד המערכת החיסונית או בריאות.
כאן אנו מתארים שיטה ממוקדת לטווח ארוך הביטוי של CXCR4 ב-murine הראשי B-1a תאים העברה המאמצת הבאים כדי להמחיש את הגירה התא וליצור נוגדנים IgM פונקציונלי (איור 1). מניפולציה גנטית של תאי B ראשי מוגבל על ידי יעילות הזיהום נמוך לעומת העברה של קווי תאים שהפכו שינוי. עם זאת, כאשר קווי תאים שעברו שינוי יכולים לסטות באופן משמעותי מתאים ראשוניים12,13, השימוש בתאים ראשיים עשוי לספק תוצאות הדוקות יותר לפיזיולוגיה נורמלית. טכניקות מספר תוארו עבור העברת גנים בתאי murine הראשי, כולל התמרה ויראלית, התמרה ויראלית, ליפוגן, או אלקטרופורציה המבוססת על מעבר, אשר יש רמות שונות של יעילות, ארעיות, והשפעה על בריאות התא13,14,15. השיטה הבאה מנוצל התמרה ויראלי כפי שהוא הניב יעילות העברת גנים נאותה של > 30% בעוד מינימלית להשפיע על הכדאיות התא. וירוס CXCR4-הביע הופק באמצעות המבנה הקודם שתוארו כretroviral יעיל לבנות תא גזע מורטין הנגיף-פנימי הזנה ריבוזומאתר-חלבון פלורסנט ירוק (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, שבו העכבר CXCR4 הגן היה משוכפל משנה4. MigR1 (בקרה (Ctl)-gfp) ו-CXCR4-gfp החלקיקים נוצרו באמצעות הזיהום סידן פוספט כפי שמתואר פרוטוקולים שפורסמו בעבר4,14.
לאחר מכן הותמרה בהצלחה בתאים B-1a והועברו באופן מידי אל לימפוציטים Rag1-/- עכברים. גם עכברים התורם וגם הנמען הכילו נוקאאוט של הגנים אפוליפופרוטאין E (apoe), אשר תוצאות הצטברות OSE מוגברת טרשת עורקים, ובכך לספק מודל עבור vivo B-1 תא הפעלה ו igm הייצור. יתר על כן, עכברים תורמים ונמענים שונים ב-CD45 allotype; התאים התורמים B-1 הגיעו מתקליטור 45.1 + ApoE-/- עכברים והועברו לתוך Rag1– Cd 45.2 + apoe-/- הנמענים. זה מותר הבידול של 45.1 CD התורם מתקליטור הנמען 45.2 B תאים שלאחר ההעברה ללא צורך להכתים בנוסף עבור סמנים תא B במהלך הניתוח cy, try הזרימה. התוצאות המסופקות כאן להדגים כי ממוקדות CXCR4 overexpression על B-1a תאים מקורביו עם יכולת מוגברת של תאים B-1a לעבור את מח העצם, אשר מקורביו עם פלזמה מוגברת anti-OSE IgM. אנו מספקים בנוסף שיטה להעשרת התאים הפריפריאלית ב -1 באמצעות בחירה שלילית ולהדגים את הדרישה של הפעלת תא B-1 לצורך התמרה יעילה. שיטה זו יכולה להיות מותאמת עבור מבנים retroviral יעיל אחרים כדי ללמוד את ההשפעה של ביטוי יתר חלבון על B-1a תא הגירה, פנוטיפ, או פונקציה. יתר על כן, השימוש CD 45.1 לעומת הבחנה CD 45.2 allotype יכול תיאורטית לאפשר העברה לתוך דגמי murine אחרים מספיק החיסונית המכילים תאים אנדוגניים B.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המסופקת כאן מאפשרת יציבה ויעילה באופן יחסי B-1a משלוח גנטי התא, בהעברה המאמצת vivo, זיהוי ולוקליזציה של תאים מוזרק. תאים זוהו 17 שבועות העברה לאחר התאים ונשמר ביטוי CXCR4 גדל. וירוס בתיווך המסירה הניבה 30-40% יעילות התמרה של הראשונית murine B-1a תאים עם השפעה מינימלית על הכדאיות התא בידינו (<strong class="x…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, פרויקט 3 של P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. מקנמרה), ו R01GM100776 (ט בנדר). A. Upadhye נתמך על ידי איגוד הלב האמריקני האגודה טרום דוקטורט 16PRE30300002 ו 5T32AI007496-20. אנו מודים לג’ואן לאנניגן, מייק סולגה, וקלוד ללעוס מאוניברסיטת וירג פלו ליבת הליבה על הסיוע הטכני המעולה שלהם.
Materials
| 70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
| anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
| B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
| CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
| CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
| CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
| CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
| CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
| CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
| Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
| CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
| CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
| F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
| Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |
Referências
- Baumgarth, N. B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production. Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location. Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).
- Prohaska, T. A., et al. Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies. Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).
- Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).
- Yang, Y., et al. Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires. Elife. 4, 09083 (2015).
- Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM. European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).
- Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells. European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).
- Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12. Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).
- Wang, H., et al. Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).
- Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).
- Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes. Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells. Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).
- Lin, K. I., Calame, K. Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors. Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).
- Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).
- DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors. Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age. The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).
- Laurie, K. L., et al. Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector. Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).
- Warncke, M., et al. Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors. Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).
- Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production. Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).
- Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response. Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).
- Baumgarth, N. The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions. Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).
