Ballistisk märkning av pyramidal neuroner i hjärnan skivor och i primär cell kultur

År 2000 beskrev Gan et al. en snabb märkningsteknik för enskilda nervceller och glia i nervsystemet som kombinerade olika lipofila färgämnen, vilket möjliggör samtidig märkning av många hjärnceller med olika färger^1,2. På senare tid, en ballistisk märkning teknik beskrevs av Seabold et al.³ som introducerade fluorescerande färgämnen (Dil) i nervceller i hjärnan skivor. En mångsidig färgning teknik, ballistiska märkning uppskattas för sin förmåga att utnyttjas i flera djurarter och över ett brett spektrum av åldrar. Dessutom kan det kombineras med immunstainning för att identifiera subpopulationer av hjärnceller³. Jämfört med traditionella tekniker (t.ex. Golgi-Cox silver impregnering, microinjection)⁴, ballistiska märkning ger en möjlighet att tydligare skilja morfologiska egenskaper, inklusive dendritiska taggar, en funktion som är avgörande för att dra slutsatser om neuronal komplexitet och synaptisk anslutning⁵.

Excitatoriska pyramidala nervceller kännetecknas av en enda, stor apical dendrit, flera kortare basala dendriter, och tusentals dendritiska taggar⁶. Pyramidala nervceller finns i flera hjärnan regioner relaterade till högre ordning kognitiv bearbetning, inklusive prefrontala cortex (PFC) och hippocampus. I PFC, pyramidala nervceller observeras i lager II/III och lager V, med varje uppvisar unika morfologi. Specifikt, pyramidala nervceller i lager II / III av PFC har en kortare apikal dendrit och mindre förgrening än pyramidala nervceller i lager V⁶. Inom hippocampus, pyramidala nervceller finns i både CA1 och CA3 regioner, med varje visar distinkta morfologier. Specifikt, pyramidala nervceller i CA1 regionen uppvisar en mer distinkt apikal dendrit, med förgrening inträffar längre från soma, i förhållande till CA3 regionen⁶.

Dendritiska taggar på pyramidala nervceller i både PFC och hippocampus är den primära platsen för excitatoriska synapser⁷. Morfologiska egenskaper hos dendritiska taggar, som klassiskt kännetecknas i tre primära kategorier (dvs. tunn, stubbig eller svamp⁸), har varit relaterade till storleken på excitatoriska synaps⁹. Tunna taggar, som kännetecknas av en lång, tunn hals, små bulbous huvud, och mindre postsynaptiska densiteter, är mer instabila och utveckla svagare anslutningar. Svampryggar, som har ett större dendritiskt ryggradshuvud, är dock erkända för att bilda starkare synaptiska anslutningar, en effekt som härrör från deras större storlek. I skarp kontrast, stubby taggar saknar en ryggrad hals, uppvisar en ungefär lika huvud och hals volymförhållande⁸. Inom hippocampus, grenade taggar kan också observeras, där ryggraden har flera huvuden som kommer ut från samma dendritiska ryggraden hals¹⁰. Därför kan morfologiska förändringar av dendritiska taggar återspegla funktionalitet och strukturell kapacitet. Dessutom har studier visat att storleken och formen på dendritiska taggar relaterar till deras strukturella plasticitet, vilket leder till tanken att små taggar är involverade i lärande och uppmärksamhet, medan större, mer stabila taggar, är involverade i långsiktiga processer, inklusive minne¹¹. Dessutom kan fördelningen av dendritiska taggar längs dendriten associeras med synaptisk anslutning^5,12.

Således har den nuvarande metodologiska papper tre mål: 1) Presentera vårt protokoll för ballistiska märkning, som har utnyttjats med en framgång (dvs. nervceller som uppfyller urvalskriterier och lämpliga för analys) av 83,3%^5,12,13 och över flera regioner i hjärnan (dvs. PFC, nucleus accumbens, hippocampus); 2) Visa generaliserbarhet av tekniken och dess tillämpning på nervceller odlas in vitro; 3) Detalj den metod som används i neuronal återuppbyggnad programvara och slutsatser som kan dras från sådana data.