קביעת יעילות מעכבי כימית נגד הצמיחה טוקסופלזמה Gondii באמצעות שיטת לוציפראז מבוססי צמיחה
Summary
מוצג כאן הוא פרוטוקול להעריך את היעילות עכבות של תרכובות כימיות נגד הצמיחה מחוץ למוח טוקסופלזמה gondii באמצעות שיטת לוציפראז מבוססי צמיחה. הטכניקה משמשת כדי לאשר את העיכוב ספציפיות על ידי מחיקה גנטית של הגן היעד המתאים. עיכוב של LHVS נגד TgCPL פרוטאז מוערך כדוגמה.
Abstract
טוקסופלזמה gondii הוא מעין פתוגן שמשפיע רבות על אוכלוסיית האדם. האנטיביוטיקה הנוכחית המשמשת לטיפול בטוקסופלזמוזיס קלינית מוגבלת. בנוסף, הם מפגינים תופעות לוואי שליליות בקבוצות מסוימות של אנשים. לכן, גילוי של therapeutics הרומן עבור טוקסופלזמוזיס קליני הוא הכרחי. השלב הראשון של פיתוח אנטיביוטי הרומן הוא לזהות תרכובות כימיות מראה יעילות גבוהה בעיכוב של גידול טפיל באמצעות אסטרטגיית הקרנת תפוקה גבוהה. כפתוגן מחייב, טוקסופלזמה יכול רק לשכפל בתוך תאים מארחים, אשר אוסרת על שימוש במידות ספיגה אופטית כאינדיקטור מהיר לצמיחה. המוצג כאן הוא פרוטוקול מפורט עבור שיטת הצמיחה מבוססי לוציפראז. כדוגמה, שיטה זו משמשת כדי לחשב את זמן ההכפלה של מסוג פראי טוקסופלזמה טפילים ולמדוד את היעילות של מוראואינאוריאה-leucyl-הומוסקסיל-ויניל סולפון פניאיל (lhvs, מתחם המיקוד של ציטוקינים ציסטאין) לגבי עיכוב של הצמיחה האנטיתאיים הטפיל. מתואר גם, הוא מבוסס CRISPR-Cas9 מבוססי הגן הפרוטוקול בטוקסופלזמה באמצעות 50 bp הומולוגי אזורים עבור שילוב מחדש תלויי הומולוגיה (HDR). על ידי כימות efficacies העכבות של LHVS ב פראי-סוג ו Tgcpl (טוקסופלזמה צנתור psin L-כמו פרוטאז)-טפילים לקוי, זה מראה כי lhvs מעכב את הצמיחה פראי סוג טפיל ביעילות רבה יותר מאשר Δcpl צמיחה, הרומז כי TGCPL הוא מטרה כי lhvs נקשר ב טוקסופלזמה. רגישות גבוהה ותפעול קל של שיטת הגדילה הזאת לוציפראז מבוססי להפוך אותו מתאים ניטור טוקסופלזמה התפשטות והערכת יעילות הסמים באופן תפוקה גבוהה.
Introduction
טוקסופלזמה gondii הוא טפיל מצליח מאוד מאוד מחייב, אשר מדביק כ שליש מהאוכלוסייה האנושית. שיעור התמסורת הגבוה ברובו נובע מנתיבי שידור מגוונים, כולל צריכת בשר מבושל, חשיפה למאגרים ממיונקים ושידור מולד במהלך הלידה. T. gondii בעיקר גורם לזיהומים אופורטוניסטים שיכולים להוביל לתחלואה חמורה ותמותה באנשים בסכנה1,2,3,4,5,6. האנטיביוטיקה המשמשת כיום לטיפול בטוקסופלזמוזיס חריפה יעילה במיוחד לטיפול בזיהומים מולדים וסמויים ולגרום לתגובות חמורות אצל אנשים מסוימים3,7,8. לכן, יש צורך דחוף לזהות therapeutics הרומן קיים. הבנת ההבדלים בתהליכים תת-תאיים בתוך טוקסופלזמה והמחשב המארח שלה יסייע לזהות יעדי סמים פוטנציאליים. לכן, יעיל ונוח טכניקות מניפולציה הגנום נדרשים ללמוד את התפקידים של גנים בודדים בתוך טוקסופלזמה. בנוסף, הטוקסופלזמה שייך ל-מערכה apicomplexa, הכולל מספר פתוגנים אנושיים משמעותיים, כגון פלסטלינה והצפנה . מכאן, טוקסופלזמה יכול לשמש כאורגניזם מודל לעזור ללמוד ביולוגיה בסיסית של טפילים apicomplexan אחרים.
כדי לזהות אנטיביוטיקה הרומן נגד פתוגנים חיידקים, הקרנת תפוקה גבוהה של ספרייה של תרכובות כימיות מבוצעת בתחילה כדי לקבוע את יעילותה בדיכוי של גידול חיידקים. עד כה, מספר הצמיחה מבוססי מיקרופלייט מבוסס כבר פותחו למדידת צמיחה תאיים של T. gondii (כלומר, רדיואקטיבי 3H-uracil התאגדות המבוססת על כימות9, מבוססי אליסה מבוסס על זיהוי טפיל באמצעות T. gondii-נוגדנים ספציפיים10,11, כתבת חלבון מדידה באמצעות β-גלטוסידאז או yfp-הביע טוקסופלזמה זנים12,13, ו שפותחה לאחרונה תוכן גבוה הדמיה ה14
לכל האסטרטגיות הבודדות יש יתרונות ייחודיים; עם זאת, מגבלות מסוימות גם מגבילות את יישומותיהם. לדוגמה, מכיוון ש- טוקסופלזמה יכול לשכפל רק בתוך תאי בעלי חיים מסוימים, התאמה אוטומטית ומחייבת לא ספציפית של נוגדנים אנטי-T. gondii כדי לארח תאים גורמים להפרעות במידות המבוססות על קרינה פלואורסצנטית. יתר על כן, השימוש באיזוטופים רדיואקטיביים דורש תאימות בטיחות מיוחדת ובעיות בטיחות פוטנציאליות. חלק מהאספניות הללו מתאימות יותר להערכת הצמיחה בנקודת זמן יחידה ולא בניטור רציף של הצמיחה.
מוצג כאן הוא פרוטוקול לוציפראז מבוסס על כימות הצמיחה טוקסופלזמה תאיים. במחקר הקודם, הננו גן לוציפראז היה משוכפל תחת טוקסופלזמה טובולין יזם, ואת זה ביטוי לוציפראז לבנות היה מנוכר לתוך פראי סוג (RHΔku80Δhxg המתח) טפילים כדי ליצור RHΔKu80Δhxg::nluc זן (המכונה RHΔku80::nluc להלן)15. זן זה שימש את זן הורים לקביעת צמיחה תאיים ומחיקה גנטית במחקר זה. שימוש RHΔku80::nluc זן, הגידול הטפיל בפיברותקיעות העורלה האנושית (hffs) היה מנוטר מעל 96 h תקופה לאחר הדלקת כדי לחשב את זמן ההכפלה של טפיל.
בנוסף, את היעילות עיכוב של LHVS נגד הצמיחה טפיל יכול להיקבע על ידי התוויית טוקסופלזמה שיעורי גדילה נגד ריכוזי lhvs סדרתי כדי לזהות את הערך IC50 . הספרות הקודמות דיווחה כי tgcpl הוא מטרה מרכזית של lhvs בטפילים, כי הטיפול עם lhvs מקטין את ההתפתחות של זיהומים טוקסופלזמה כרוניים חריפה16,17,18,19. בנוסף, RHΔku80:: nluc שימש זן הורים לשינוי הגנום כדי ליצור מאמץ לקוי של tgcpl(RHΔku80Δcpl::nluc), ואת העיכוב של lhvs נמדד נגד מוטציה זו. על ידי התבוננות upshift של IC50 ערכים עבור LHVS ב tgcplלקויה טפילים לעומת זן WT, זה היה מאומת כי tgcpl הוא ממוקד על ידי lhvs ב vivo.
בפרוטוקול זה, RHΔku80::nluc משמש זן הורים, אשר חסר יעיל בלתי הומוולוגי מסלול להצטרף בסוף (nhej), ובכך להקל כפול מוצלב הומולוגיה התלויים שילוב מחדש (HDR)20,21. בנוסף, האזורים 50 bp הומולוגיים מקיפים בשני קצותיו של קלטת התנגדות לסמים על ידי ה-PCR. המוצר PCR משמש תבנית תיקון כדי להסיר את מקום הגן כולו באמצעות HDR באמצעות CRISPR-Cas9-מבוססי הגנום כלים לעריכת. ניתן לשלב בקלות את אזורי ההומוולוגי הקצרים האלה לתוך התחל, ולספק אסטרטגיה נוחה לייצור תבנית התיקון. פרוטוקול זה ניתן לשנות כדי לבצע מחיקה גנטית אוניברסלית תיוג גנים אנדוגני.
למשל, בפרסום האחרון שלנו, שלושה גנים הפרוטאז, Tgcpl, tgcpb (טוקסופלזמה צנתור psin B-כמו פרוטאז), ו TgSUB1 (טוקסופלזמה sub sin כמו פרוטאז 1), היו מבחינה גנטית בתוך tgcpl (טוקסופלזמה כלורוקין-התנגדות טרנספורטר)-טפילים לקוי בשיטה זו15. בנוסף, tgamn (הבנה n [tgamn, TGGT1_221310]) היה מתויג באופן שורש15. מעבדת Lourido דיווחו גם באמצעות אזורים הומולוגיים קצרים בטווח של 40-43 bp למבוא של מוטציה באתר מכוון גנים והתיוג הגן אנדודוגני בגנום טוקסופלזמה באמצעות שיטה דומה22. אלה שינויים הגנום מוצלחת מראים כי אזור bp הומולוגי 40-50 מספיק עבור DNA יעיל שילוב מחדש במתח TgKU80-לקוי, אשר מפשט מאוד את מניפולציה הגנום ב טוקסופלזמה gondii.
Protocol
Representative Results
Discussion
+ + פרוטוקול זה מתאר פרוטוקול לוציפראז מבוסס להערכת צמיחה טוקסופלזמה תאיים ולהעריך את היעילות עיכוב של תרכובות כימיות נגד גידול טפיל. בהשוואה אסטרטגיות קיימות זמין למדידת צמיחה תאיים טוקסופלזמה , שיטה זו מציגה רגישות גבוהה וספציפיות. בעת ניטור הצמיחה טפיל, שינון מבוים ברור 96 היט?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לד. סיבלי וקארותרס לשיתוף pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT פלאמיד ואנטי-TgCPL ו-TgActin נוגדנים. עבודה זו נתמכת על ידי קרן ההפעלה קלמסון (כדי Z.D.), אבירים הטמפלרים עין קרן רפואת עיניים הקריירה-Starter מחקר מענק (כדי Z.D.), מענק הטייס של מענק NIH COBRE P20GM109094 (כדי Z.D.), ו-NIH R01AI143707 (כדי Z.D.). לתורמים לא היה כל תפקיד בתכנון לימוד, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
Materials
| Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
| BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
| Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
| Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
| Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
| Software | |||
| Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
| GraphPad Prism software (8th version) | |||
| SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |
Referências
- Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).
- Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. P. Toxoplasma gondii Seroprevalence in the United States 2009-2010 and Comparison with the Past Two Decades. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 90 (6), (2014).
- Kieffer, F., Wallon, M. Congenital toxoplasmosis. Handbook of Clinical Neurology. 112, 1099-1101 (2013).
- Hoffmann, S., Batz, M. B., Morris, G. J. Annual cost of illness and quality-adjusted life year losses in the United States due to 14 foodborne pathogens. Journal of Food Protection. 75 (7), 1292-1302 (2012).
- Dubey, J. Toxoplasmosis. Journal of the American Veterinary Medical Association. 205 (11), 1593-1598 (1994).
- Lindsay, D., Dubey, J. Toxoplasma gondii: the changing paradigm of congenital toxoplasmosis. Parasitology. 138 (14), 1-3 (2011).
- Deng, Y., Wu, T., Zhai, S., Li, C. Recent progress on anti-Toxoplasma drugs discovery: Design, synthesis and screening. European Journal of Medicinal Chemistry. 183, 111711 (2019).
- Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. Ocular toxoplasmosis II: clinical features, pathology and management. Clinical & Experimental Ophthalmology. 41 (1), 95-108 (2013).
- Pfefferko, E., Pfefferko, L. C. Specific Labeling of Intracellular Toxoplasma gondii with Uracil. Journal of Eukaryotic Microbiology. 24 (3), 449-453 (1977).
- Merli, A., Canessa, A., Melioli, G. Enzyme immunoassay for evaluation of Toxoplasma gondii growth in tissue culture. Journal of Clinical Microbiology. 21 (1), 88-91 (1985).
- Derouin, F., Chastang, C. Enzyme immunoassay to assess effect of antimicrobial agents on Toxoplasma gondii in tissue culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 32 (3), 303-307 (1988).
- McFadden, D., Seeber, F., Boothroyd, J. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
- Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. High-Throughput Growth Assay for Toxoplasma gondii Using Yellow Fluorescent Protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (1), 309-316 (2003).
- Touquet, B., et al. High-content imaging assay to evaluate Toxoplasma gondii infection and proliferation: A multiparametric assay to screen new compounds. PLoS ONE. 13 (8), e0201678 (2018).
- Thornton, L. B., et al. An ortholog of Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT) plays a key role in maintaining the integrity of the endolysosomal system in Toxoplasma gondii to facilitate host invasion. PLOS Pathogens. 15 (6), e1007775 (2019).
- Larson, E. T., et al. Toxoplasma gondii cathepsin L is the primary target of the invasion-inhibitory compound morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl. The Journal of Biological Chemistry. 284 (39), 26839-26850 (2009).
- Dou, Z., McGovern, O. L., Cristina, M., Carruthers, V. B. Toxoplasma gondii Ingests and Digests Host Cytosolic Proteins. mBio. 5 (4), e01188-14 (2014).
- Cristina, M., et al. Toxoplasma depends on lysosomal consumption of autophagosomes for persistent infection. Nature Microbiology. 2, 17096 (2017).
- Parussini, F., Coppens, I., Shah, P. P., Diamond, S. L., Carruthers, V. B. Cathepsin L occupies a vacuolar compartment and is a protein maturase within the endo/exocytic system of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 76 (6), 1340-1357 (2010).
- Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80. Eukaryotic cell. 8 (4), 530-539 (2009).
- Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryotic Cell. 8 (4), 520-529 (2009).
- Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii Using CRISPR/Cas9. PLoS ONE. 9 (6), e100450 (2014).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, D. L. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), e01114-14 (2014).
- Radke, J. R., et al. Defining the cell cycle for the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii. Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (2), 165-175 (2001).
- Ran, A. F., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 2812 (2014).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomics. 1 (4), e000033 (2015).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
