In Situ Detectie van Ribonucleoprotein Complex Assembly in de C. elegans Germline met behulp van Proximity Ligation Assay

Meer dan 80% van de eiwitten wordt geschat op interacties met andere moleculen¹, die benadrukt hoe belangrijk PPR’s zijn voor de uitvoering van specifieke biologische functies in de cel². Sommige eiwitten functioneren als hubs die de assemblage van grotere complexen vergemakkelijken die nodig zijn voor celoverleving¹. Deze hubs bemiddelen meerdere PPR’s en helpen eiwitten te organiseren in een netwerk dat specifieke functies in een cel³faciliteert. Vorming van eiwitcomplexen wordt ook beïnvloed door biologische context, zoals de aanwezigheid of afwezigheid van specifieke interactiepartners^4,celsignaleringsgebeurtenissen en ontwikkelingsfase van een cel.

C. elegans wordt vaak gebruikt als een model organisme voor een verscheidenheid van studies, met inbegrip van ontwikkeling. De eenvoudige anatomie van dit dier bestaat uit verschillende organen, waaronder de gonad, darm en transparante nagelriem, die de analyse van wormontwikkeling vergemakkelijkt. De kiembaan die in de gonad is een geweldig hulpmiddel om te bestuderen hoe kiembaan stamcellen rijpen in gameten⁵ die zich ontwikkelen tot embryo’s en uiteindelijk de volgende generatie van nakomelingen. Het distale tipgebied van de kiembaan bevat een pool van zelfvernieuwende stamcellen (Figuur 1). Als stamcellen de niche verlaten, gaan ze verder naar de meiotische pachytene en ontwikkelen ze zich uiteindelijk tot eicellen in het stadium van de jonge volwassene (Figuur 1). Dit programma van ontwikkeling in de kiembaan is strak geregeld door middel van verschillende mechanismen, met inbegrip van een post-transcriptie regelgevend netwerk vergemakkelijkt door RNA-bindende eiwitten (RBPs)⁶. PPR’s zijn belangrijk voor deze regelgevende activiteit, omdat rbp’s associëren met andere cofactoren om hun functies uit te oefenen.

Er zijn verschillende benaderingen die kunnen worden gebruikt om te sonde voor PPR’s in de worm, maar elk heeft unieke beperkingen. In vivo immunoneerslag (IP) kan worden gebruikt om eiwit-eiwitcomplexen te isoleren uit hele wormextracten; Deze aanpak geeft echter niet aan waar de PPI in de worm voorkomt. Bovendien kunnen eiwitcomplexen die van voorbijgaande aard zijn en zich alleen vormen tijdens een specifiek ontwikkelingsstadium of in een beperkt aantal cellen, moeilijk te herstellen zijn door co-immunoprecipitatie. Ten slotte moeten IP-experimenten de zorgen van eiwitcomplex reassortiment na lyse en niet-specifieke retentie van eiwitten op de affiniteitsmatrix aanpakken.

Alternatieve benaderingen voor in situ detectie van PPR’s zijn co-immunostaining, Förster resonantie energieoverdracht (FRET) en bimoleculaire fluorescentiecomplementatie (BiFC). Co-immunostaining is gebaseerd op gelijktijdige detectie van twee eiwitten die van belang zijn voor vast wormweefsel en het meten van de mate van signaalcolokalisatie. Het gebruik van super-resolutie microscopie, die meer detail biedt dan standaard microscopie⁷, helpt om eiwitcolokalisatie strenger te testen voorbij de diffractie-beperkte barrière van 200-300 nm⁸. Co-immunostaining met zowel conventionele als superresolutiemicroscopie werkt echter het beste voor eiwitten met goed gedefinieerde lokalisatiepatronen. Daarentegen wordt het veel minder informatief voor diffuus gedistribueerde interactiepartners. Het meten voor co-lokalisatie van signalen op basis van overlap geeft geen nauwkeurige informatie over de vraag of de eiwitten in complex met elkaar^9,10.

Bovendien zijn co-immunoneerslag en co-immunostaining van eiwit-eiwitcomplexen niet kwantitatief, waardoor het moeilijk is om te bepalen of dergelijke interacties significant zijn. FRET en BiFC zijn beide fluorescerende technieken. FRET vertrouwt op het taggen van eiwitten die van belang zijn met fluorescerende eiwitten (FPs) die spectrale overlap hebben waarbij energie van de ene FP (donor) wordt overgedragen naar een andere FP (acceptor)¹¹. Deze niet-stralingsoverdracht van energie resulteert in fluorescentie van de acceptor FP die kan worden gedetecteerd op de respectieve golflengte van de emissie. BiFC is gebaseerd op de reconstructie van een fluorescerend eiwit in vivo. Het houdt in dat GFP wordt opgesplitst in twee complementaire fragmenten, zoals helices 1-10 en helix 11¹², die vervolgens worden samengevoegd tot twee eiwitten van belang. Als deze twee eiwitten op elkaar inwerken, worden de complementaire fragmenten van GFP dicht genoeg in de nabijheid om te vouwen en te monteren, waardoor de GFP-fluorophore opnieuw wordt samengesteld. Gereconstitueerde GFP wordt dan direct geobserveerd als fluorescentie en geeft aan waar een PPI is opgetreden.

Als zodanig zijn zowel FRET als BiFC afhankelijk van grote fluorescerende tags die de functie van het gelabelde eiwit kunnen verstoren. Daarnaast hebben FRET en BiFC een overvloedige en vergelijkbare expressie van de gelabelde eiwitten nodig om nauwkeurige gegevens te verkrijgen. FRET is mogelijk niet geschikt voor experimenten waarbij de ene partner groter is dan de andere, wat kan leiden tot een hoge achtergrond¹³. Overexpressie in BiFC-experimenten moet ook worden vermeden, omdat dit niet-specifieke assemblage kan veroorzaken¹⁴ die resulteert in een verhoogde achtergrond. Beide technieken vereisen optimalisatie van expressie en beeldvorming svan de gelabelde eiwitten, die de tijd die nodig is om experimenten te voltooien kan verlengen.

De nabijheidsligatietest (PLA) is een alternatieve benadering die de beperkingen van de hierboven genoemde technieken kan aanpakken. PLA maakt gebruik van primaire antilichamen die de eiwitten van belang (of hun tags) herkennen. Deze primaire antilichamen worden dan gebonden door secundaire antilichamen die oligonucleotidesondes bevatten die met elkaar kunnen hybridiseren wanneer binnen een afstand van 40 nm (of kortere)¹⁵. Het resulterende gehybridiseerde DNA wordt versterkt door middel van een PCR-reactie, die wordt gedetecteerd door sondes die het DNA aanvullen. Dit resulteert in foci die worden gevisualiseerd door een microscoop. Deze technologie kan PPR’s in situ detecteren in complexe weefsels (d.w.z. de wormgonad), die is georganiseerd als een assemblagelijn met cellen in verschillende stadia van ontwikkeling en differentiatie. Met PLA kunnen PPR’s direct worden gevisualiseerd in een vaste wormgonad, wat voordelig is om te onderzoeken of PPR’s optreden tijdens een specifieke ontwikkelingsfase. PLA biedt een betere resolutie van PPR’s in tegenstelling tot co-lokalisatie-gebaseerde testen, die ideaal is voor het maken van nauwkeurige metingen. Indien gebruikt, super-resolutie microscopie heeft het potentieel om fijnere details over de locatie van PLA foci in een cel. Een ander voordeel is dat de foci als gevolg van PLA reacties kan worden geteld door een ImageJ-gebaseerde analyse workflow, waardoor deze techniek kwantitatief.

De LC8 familie van dynein lichtketens werd voor het eerst beschreven als een subunit van de dynein motor complex¹⁶ en veronderstelde om te dienen als een lading adapter. Sinds de eerste ontdekking is LC8 gevonden in meerdere eiwitcomplexen naast het dynein motorcomplex^17,18,19,20. Scannen op eiwitsequenties die het LC8-interactiemotief¹⁹ bevatten, suggereert dat LC8 veel interacties kan hebben met een breed scala aan verschillende eiwitten^{17,18,19,20,21,22}. Als gevolg hiervan worden LC8-gezinseiwitten nu beschouwd als hubs die de assemblage van grotere eiwitcomplexen helpen bevorderen^19,22, zoals samenstellingen van intrinsiek ongeordende eiwitten²¹.

Een C. elegans LC8-familie eiwit, dynein licht keten-1 (DLC-1), wordt op grote schaal uitgedrukt in vele weefsels en niet verrijkt in specifieke subcellulaire structuren^23,24. Bijgevolg is de identificatie van biologisch relevante in vivo partners van DLC-1 in C. elegans om een aantal redenen een uitdaging: 1) co-immunoneerslag geeft niet de weefselbron aan waar de interactie plaatsvindt; 2) een beperkte expressie van bepaalde partners of tijdelijke interacties kan het vermogen belemmeren om een interactie door co-immunoneerslag op te sporen; en 3) diffuse distributie van DLC-1 leidt tot niet-specifieke overlap met potentiële partnereiwitten door co-immunostaining. Op basis van deze uitdagingen is PLA een ideale aanpak voor het testen van in vivo interacties met DLC-1.

Eerder werd gemeld dat DLC-1 rechtstreeks interageert met en dient als een cofactor voor de RNA-bindende eiwitten (RBPs) FBF-2²³ en GLD-1²⁵. Ons werk ondersteunt het model van DLC-1 dat als hub-eiwit fungeert en suggereert dat DLC-1 een interactienetwerk faciliteert dat zich uitstrekt tot voorbij dynein^19,22. Met behulp van een GST pulldown test, een nieuwe DLC-1-interactie RBP genaamd OMA-1 is geïdentificeerd²⁶. OMA-1 is belangrijk voor de groei van de eicellen en de menotische rijping²⁷ en functioneert in combinatie met een aantal translationele repressors en activators²⁸. Hoewel FBF-2 en GLD-1 worden uitgedrukt in respectievelijk de stamcellen en meiotische pachytenegebieden, wordt OMA-1 diffuus uitgedrukt in de kiembaan van de meiotische pachytene via de eicellen²⁷ (figuur 1). Dit suggereert dat DLC-1 complexen vormt met RBPs in verschillende regio’s van de gonad. Ook is gebleken dat de directe interactie tussen DLC-1 en OMA-1 waargenomen in vitro niet wordt hersteld door een in vivo IP. De PLA is met succes gebruikt als een alternatieve aanpak om deze interactie verder te bestuderen in de C. elegans kiembaan, en de resultaten suggereren dat PLA kan worden gebruikt om vele andere PPR’s in de worm sonde.