हम एक अनुकूलित टैंडेम मास टैग (टीएमटी) लेबलिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें निम्नलिखित चरणों में से प्रत्येक के लिए विस्तृत जानकारी शामिल है: प्रोटीन निष्कर्षण, मात्रा, वर्षा, पाचन, लेबलिंग, एक प्रोटेओमिक्स सुविधा के लिए प्रस्तुत करना, और डेटा विश्लेषण।
प्रोटेओमिक प्रौद्योगिकियां शक्तिशाली तरीके हैं जो पूरे प्रोटेम पर रोग, उपचार या अन्य स्थिति के प्रभाव का वैश्विक दृष्टिकोण प्रदान करके जैविक प्रणालियों में कार्रवाई के तंत्र की हमारी समझ को सहायता कर सकती हैं। यह रिपोर्ट प्रोटीन नमूनों के निष्कर्षण, मात्रा, वर्षा, पाचन, लेबलिंग और बाद में डेटा विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करती है। हमारे अनुकूलित टीएमटी लेबलिंग प्रोटोकॉल के लिए कम टैग-लेबल एकाग्रता की आवश्यकता होती है और लगातार विश्वसनीय डेटा प्राप्त होता है। हमने विभिन्न प्रकार के माउस ऊतकों (यानी दिल, कंकाल मांसपेशी और मस्तिष्क) के साथ-साथ विट्रो में सुसंस्कृत कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का मूल्यांकन करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है। इसके अलावा, हम प्रदर्शित करते हैं कि परिणामी डेटासेट से हजारों प्रोटीन का मूल्यांकन कैसे किया जाता है।
“प्रोटेओमिक्स” शब्द को पहले कोशिका, ऊतक या जीव1के पूरे प्रोटीन पूरक के बड़े पैमाने पर लक्षण वर्णन के रूप में परिभाषित किया गया था। प्रोटेओमिक विश्लेषण प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर2के सापेक्ष मात्रा प्रदर्शन करने के लिए तकनीकों का उपयोग करके रोग विकास, चिकित्सीय रास्ते और स्वस्थ प्रणालियों में शामिल तंत्र और सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच को सक्षम करते हैं। इस तरह के अध्ययनों के प्रारंभिक विवरण 1 9 75 में प्रकाशित किए गए थे और इस उद्देश्य1,,3 के लिए दो-आयामी पॉलीएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (2डी-पेज) के उपयोगकाप्रदर्शन किया। 2डी विधि चार्ज (आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग, आईईएफ) और आणविक द्रव्यमान (सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीएक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस, या एसडीएस-पेज)4के आधार पर प्रोटीन को अलग करती है। वर्षों के लिए, प्रत्येक जेल घटक पर किए गए 2D-PAGE और बाद में मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री का संयोजन सबसे आम अलक्षित प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण तकनीक थी और कई पहले से अज्ञात प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल5,,6की पहचान की गई थी। 2D-PAGE दृष्टिकोण के सामान्य नुकसान यह हैं कि यह समय लेने वाला है, हाइड्रोफोबिक प्रोटीन के लिए अच्छी तरह से काम नहीं करता है, और कम संवेदनशीलता7,,8के कारण मूल्यांकन किए गए प्रोटीन की कुल संख्या में सीमाएं हैं।
सेल कल्चर (SILAC) विधि में अमीनो एसिड द्वारा स्थिर आइसोटोप लेबलिंग नमूनों9में प्रोटीन बहुतायत की पहचान करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए अगला लोकप्रिय दृष्टिकोण बन गया। इसमें कोशिकाओं की मेटाबोलिक लेबलिंग होती है जो मध्यम में एक मानक आवश्यक अमीनो एसिड की कमी होती है और उस विशिष्ट अमीनो एसिड10के आइसोटोप लेबल वाले संस्करण के साथ पूरक होती है। इस तकनीक का लाभ इसकी दक्षता और सटीक लेबलिंग9है । SILAC दृष्टिकोण के लिए मुख्य सीमा मुख्य रूप से कम सेल विकास दर आइसोटोप लेबल समावेश की वजह से है, जो विशेष रूप से अपेक्षाकृत संवेदनशील सेल लाइनों में चुनौतीपूर्ण हो सकता है मानवरोगों मॉडलिंग 11।
2003 में, एक उपन्यास और मजबूत प्रोटेओमिक्स तकनीक जिसमें टैंडेम मास टैग (टीएमटी) आइसोबेरिक लेबल शामिल हैं, जिसे12क्षेत्र में पेश किया गया था। टीएमटी लेबलिंग एक शक्तिशाली तरीका है क्योंकि इसकी बढ़ी हुई संवेदनशीलता है ताकि सापेक्ष प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर और पोस्टट्रांसलेशनलसंशोधनों कापता लगाया जा सके । इस प्रकाशन की तारीख के रूप में, टीएमटी किट विकसित की गई है जो एक साथ 6, 10, 11 या 16 नमूनों को लेबल कर सकती है। नतीजतन,14,,15,,16में जैविक प्रतिकृति के साथ कई परिस्थितियों में पेप्टाइड बहुतायत को मापना संभव है। हमने हाल ही में बार्थ सिंड्रोम (बीटीटीएस)17के माउस मॉडल के कार्डियक प्रोटेओमिक प्रोफाइल की विशेषता के लिए टीएमटी का उपयोग किया था। ऐसा करने में, हम जीन थेरेपी के साथ इलाज BTHS चूहों के हृदय प्रोफाइल में व्यापक सुधार प्रदर्शित करने में सक्षम थे और BTHS द्वारा प्रभावित उपन्यास प्रोटीन की पहचान है कि उपन्यास चिकित्सकीय कार्डियोमायोपैथी में शामिल रास्ते से पता चला ।
यहां, हम ऊतक नमूनों या सेल छर्रों का उपयोग करमल्टीप्लेक्स टीएमटी मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स विश्लेषण करने के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करते हैं। यह नमूना तैयारी और लेबलिंग एक कोर करने के लिए प्रस्तुत करने से पहले प्रदर्शन करने के लिए फायदेमंद हो सकता है क्योंकि लेबल ट्राइप्टिक पेप्टाइड्स कच्चे जमे हुए नमूनों की तुलना में अधिक स्थिर हैं, नहीं सभी कोर सभी नमूना प्रकार से निपटने का अनुभव है, और एक प्रयोगशाला में नमूने तैयार करने कोर के लिए समय बचा सकता है, जो अक्सर लंबे बैकलॉग है । इस प्रक्रिया के द्रव्यमान स्पेक्ट्रोस्कोपी भाग के विस्तृत विवरण के लिए कृपया किरशेनबॉम एट अल और पेरुमल एट अल18,,19देखें।
नमूना तैयारी प्रोटोकॉल में निम्नलिखित प्रमुख कदम होते हैं: निष्कर्षण, मात्रा, वर्षा, पाचन और लेबलिंग। इस अनुकूलित प्रोटोकॉल के प्रमुख लाभ यह हैं कि यह लेबलिंग की लागत को कम करता है, प्रोटीन निष्कर्षण में सुधार करता है, और लगातार उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उत्पन्न करता है। इसके अलावा, हम कम समय में हजारों प्रोटीन को स्क्रीन करने के लिए टीएमटी डेटा का विश्लेषण करने का वर्णन करते हैं। हमें उम्मीद है कि यह प्रोटोकॉल अन्य शोध समूहों को अपने अध्ययन में इस शक्तिशाली पद्धति को शामिल करने पर विचार करने के लिए प्रोत्साहित करता है ।
टीएमटी आधारित आइसोबेरिक स्थिर आइसोटोप लेबलिंग पद्धतियों का उपयोग करके प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए नमूने सफलतापूर्वक तैयार करने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन निष्कर्षण बहुत सावधानी से करना और एक लाइसिस बफर का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जिसमें एक प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल24,,25शामिल है। प्रोटीन पाचन के दौरान अप्रत्याशित प्रोटीन क्षरण से बचने के लिए प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल एक महत्वपूर्ण अभिकर्ता है। हमारे प्रोटोकॉल और विक्रेता द्वारा प्रदान की गई वर्तमान एक के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर यह है कि हम स्तनधारी कोशिकाओं और ऊतकों के साथ हमारे अनुभव के आधार पर चैप्स लिसिस बफर के उपयोग की दृढ़ता से सलाह देते हैं। हम कोशिका छर्रों और ऊतकों दोनों के लिए मेथनॉल/क्लोरोफॉर्म प्रोटीन वर्षा दृष्टिकोण का उपयोग करने का भी सुझाव देते हैं ।
आदर्श रूप में, प्रोटीन निष्कर्षण, माप, कम करने/alkylating अभिकर्मक उपचार, और मेथनॉल/क्लोरोफॉर्म वर्षा सभी एक ही दिन किया जाता है । इस सिफारिश के बाद बाद लेबलिंग के लिए और अधिक सटीक प्रोटीन सांद्रता में परिणाम होगा । प्रोटीन वर्षा कदम अभिकर्मकों को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है जो मिलकर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री में हस्तक्षेप करेगा। वर्षा चरण सहित टीएमटी26के संकल्प को काफी बढ़ाता है । संक्षेप में, हमारे टीएमटी प्रोटोकॉल के प्रमुख फायदे विभिन्न प्रकार के नमूनों, इसकी प्रजनन क्षमता और प्राप्त विश्वसनीय डेटा के लिए उच्च लेबलिंग क्षमता हैं।
चूंकि इस टीएमटी अनलक्षित प्रोटेओमिक्स रणनीति की मल्टीप्लेक्स प्रकृति का विस्तार जारी है, इसलिए यह उपन्यास खोजों को बनाने के लिए विभिन्न क्षेत्रों में शोधकर्ताओं की क्षमता को उत्तरोत्तर बढ़ाएगा । विशेष रूप से जैव चिकित्सा क्षेत्र में, हमने और अन्य लोगों ने इस तकनीक को रोग में कार्रवाई के उपन्यास तंत्र और विभिन्न चिकित्सीय के सापेक्ष प्रभावों की खोज करने वाले अध्ययनों में तेजी से जानकारीपूर्ण पाया है। इन सभी कारणों से, यह शक्तिशाली तकनीक आधुनिक अनुसंधान अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले अन्य OMICS दृष्टिकोणों के प्रदर्शनों की सूची का पूरक है और महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करती है जो आगे चिकित्सीय विकास का मार्गदर्शन कर सकती है।
The authors have nothing to disclose.
हम अपने नमूनों के प्रसंस्करण के लिए यूएफ-आईसीबीआर प्रोटेओमिक्स सुविधा को स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानR01 HL136759-01A1 (कैप) द्वारा समर्थित किया गया था ।
1 M Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 50 mL | Thermo Fisher | 90114 | Reagent for protein labeling |
50% Hydroxylamine, 5 mL | Thermo Fisher | 90115 | Reagent for protein labeling |
Acetic acid | Sigma | A6283 | Reagent for protein digestion |
Anhydrous acetonitrile, LC-MS Grade | Thermo Fisher | 51101 | Reagent for protein labeling |
Benzonaze nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | DNA shearing |
Bond-Breaker TCEP solution, 5 mL | Thermo Fisher | 77720 | Reagent for protein labeling |
BSA standard | Thermo | 23209 | Reagent for protein measurement |
CHAPS | Thermo Fisher | 28300 | Reagent for protein extraction |
Chloroform | Fisher | BP1145-1 | Reagent for protein precipitation |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 4693132001 | Reagent for protein extraction |
DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | Reagent for protein measurement |
Excel | Microsoft Office | Software for data analyses | |
Heat block | VWR analog | 12621-104 | Equipment for protein digestion incubation |
HEPES | Sigma | RDD002 | Reagent for protein extraction |
Methanol | Fisher | A452-4 | Reagent for protein precipitation |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Fisher | 90058 | Reagent for protein digestion |
Potassium chloride | Sigma | 46436 | Reagent for protein extraction |
Sigma Plot 14.0 | Sigma Plot 14.0 | Software for data analyses | |
Sonicator | Fisher Scientific | FB120 | DNA shearing |
Spectra Max i3x Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | Plate reader for protein measurement | |
Thermo Scientific Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Reagent for protein measurement |
Thermo Scientific Pierce Quantitative Fluorescent Peptide Assay | Thermo Fisher | 23290 | Reagent for protein measurement |
Thermo Scientific Proteome Discoverer Software | Thermo Fisher | OPTON-30945 | Software for data analyses |
TMT 10plex Isobaric Label Reagent Set 0.8 mg, sufficient reagents for one 10plex isobaric experiment | Thermo Fisher | 90110 | Reagent for protein labeling |
TMT11-131C Label Reagent 5 mg | Thermo Fisher | A34807 | Reagent for protein labeling |
Water, LC-MS Grade | Thermo Fisher | 51140 | Reagent for protein extraction |