蛋白质组学设施提交和后续数据分析的TMT样品制备

佛罗里达大学的机构动物护理和使用委员会批准了所有动物研究。 1. 试剂的制备 准备 CHAPS Lysis 缓冲液（150 mM KCl，50 mM HEPES pH = 7.4，0.1% CHAPS，每 50 mL 缓冲 1 片蛋白酶抑制剂鸡尾酒片）。不含蛋白酶抑制剂的缓冲剂可在4°C下储存长达6个月，或将蛋白酶抑制剂储存在-20°C至1年。 制备100 mM三聚二苯甲酸酯（TEAB）：将500μL的1MTEAB添加到4.5mL的超纯水。 准备200 mM三分（2卡盒叶）磷酸（TCEP）：将70μL的0.5M TCEP（变性试剂）添加到70μL的超纯水。然后加入35μL的1MTEAB。 制备 5% 羟基胺：将 50 μL 的 50% 羟基胺添加到 450 μL 的 100 mM TEAB。 2. 蛋白质提取 根据 IACUC 批准的协议，将四头肌与安乐死小鼠分离。冻结并保持在-80°C或继续协议立即使用。 切切分离约10毫克的新鲜或冷冻四头肌小鼠组织。使用骨骼肌时使用钳子分离纤维。或者，如果使用细胞培养，在 CHAPS 赖塞缓冲液的 300 μL 中重新挂起 ±3 x 106细胞，然后跳到步骤 2.4。 使用 2 mL 管将组织均匀化，管中填充约 200 μL 的 1 mm 硅珠/硅珠和 500 μL 的 CHAPS 水成石解缓冲液。根据需要向上或向下缩放（例如，在 250 μL 的 CHAPS 乳液缓冲液中 5 毫克的组织）。 执行声波（10倍，每10秒，50%振幅和30秒的冰间隔），释放与DNA结合的蛋白质。通过将水化酶通过连接到1 mL注射器的21 G针头传递10倍，或者通过37°C的苯酶孵育（44 U/mL）30分钟，可以实现相同的DNA降解结果。 在4°C下将水清液在16，000 x g下离心10分钟，并将上清液转移到新的离心管。 3. 蛋白质测量 使用已建立的协议确定上清剂的蛋白质浓度（参见材料表）。注：最好在 ±2 μg/μL 下使用样品，但也可以使用浓度较低的样品。如果使用浓度较低的样品，则需要在步骤 5.1 中适当调整还原/烷化试剂的体积。 使用 CHAPS 水合液缓冲液准备 BSA 标准曲线稀释。 按照制造商的说明操作，15 分钟后，在 750 nm 处读取吸光度。 4. 减少/烷基化试剂处理 将每个条件200μg的蛋白质转移到新的离心管中，并使用CHAPS乳液缓冲液调整到最终体积为100μL。当蛋白质浓度过低时，可以扩展到200μL，但不要忘记适当调整还原/烷化试剂的体积。 加入5 μL的200 mM TCEP，并在55°C下孵育样品1小时。 在使用前，立即将一管碘酰胺（即9毫克）溶解到132 μL的100 mM TEAB中制备375 mM碘酰胺。保护此解决方案免受光照。 在样品中加入5μL的375 mM碘酰胺，并在室温（RT）保护下孵育30分钟。 5. 甲醇/氯仿降水20 在每个100μL的蛋白质和短暂涡旋样品中加入400μL甲醇。 在 RT 时在 9，000 x g时离心 10 s。这是结合液体沉积在样品管的两侧。 在混合物中加入100μL氯仿，并短暂涡旋。如果样品的磷脂浓度较高，请使用200μL的氯仿。 在 RT 时在 9，000 x g时离心 10 s。这是结合液体沉积在样品管的两侧。 大力加入300μL的水和涡流。获得同质解决方案非常重要。 在 RT 处，在 9，000 x g处离心 1 分钟，在将管转移到机架时，请格外小心，以免干扰层。注：管子现在应该包含三个阶段：1）顶层（即上清），水和甲醇的混合物;2）中间层（即相间），白色沉淀蛋白;和3）底层（即底部相），氯仿。 小心地取出上清液。 在剩余的相位和底部相中加入300μL甲醇。漩涡大力。 在 RT 处，在 9，000 x g处离心 2 分钟，在将管转移到机架时，请格外小心，避免干扰层。 小心地取出上清液。 在 RT 处在气流下（例如，使用真空集中器）轻轻吸气尽可能多的液体，直到颗粒稍微潮湿（约 10 分钟）。由于每个样本的必要时间可能不同，请每 2 分钟检查一次以评估。将颗粒储存在-80°C，直到进一步加工。 6. 蛋白质消化 在TEAB赖塞缓冲液的100μL中重新悬浮沉淀蛋白颗粒。注：在此步骤中测量蛋白质浓度是可选的。 在使用前，立即制备1 μg/μL胰蛋白酶，在100μg胰蛋白酶玻璃瓶底部加入100μL的胰蛋白酶储存溶液（50 mM醋酸），并在RT储存剩余试剂中孵育5分钟，一次性剂量为-80°C。 每100 μg蛋白质加入2.5μL的胰蛋白酶。在37°C下通宵消化样品。此步骤对于蛋白质的完全溶解至关重要;不要修改这些条件。消化后，使用标准蛋白质测定测量蛋白质浓度是可选的。 7. 肽标签 在使用前，将 TMT 标签套件试剂与 RT 进行平衡。 通过在每个管中添加41μL的无水乙酰甲酸酯，溶解每个0.8mg TMT标签小瓶。在 RT 孵化试剂 5 分钟，偶尔进行旋涡。暂时使管离心。注：0.8mg TMT 标签的浓度通常足以标记两组。然而，其他调查人员已经证明，这种浓度可以进一步降低，仍然产生可靠的数据15。 小心地将 41 μL 的 TMT 标签试剂添加到每个 100 μL 样品中。 在 RT 处孵化反应 1 小时。 在样品中加入8μL的5%羟基胺，孵育15分钟以淬火反应。 将样品分成相同数量的新离心管，储存在-80°C。注：在此步骤中，样品是稳定的，可以提交进行质谱。使用标准蛋白质测定来测量浓度是可选的。 8. 质谱 将样品提交到蛋白质组学设施（本研究使用 UF ICBR 蛋白质组学核心设施），其中所有样本都使用 C18 旋转柱进行组合和纯化。注：与核心设施讨论如何在准备样品之前提交样品，以确认他们喜欢提交的具体步骤。 请求每个组合多路复用样品的以下程序：固相提取、HPLC（SCX、SE）、拉链笔尖和LC-MS/MS（蛋白质 ID的2小时梯度，如果 >10QE Plus）。 收集数据后，核心设施将使用供应商提供的蛋白质识别软件处理 RAW 文件。 9. 数据分析 数据通常以 7z 格式从内核返回用户，每个数据集可能需要大约 16 GB 的磁盘空间（在本例中为 11 个示例）。对于数据处理，请确保计算机可用时至少为 3.4 GHz。 使用 7-Zip 文件管理器提取文件。这些提取的文件包含 RAW 数据、pdStudy 格式文件和 pdResultView 格式文件。保存所有文件以进行进一步分析。 使用 Proteome 发现 2.2 软件打开文件。注： 文件格式为”文件名.pd研究”。如果打开”文件名.pdResultView”，则无法选择控制示例。 在”样本”面板上选择控制样本。 通过在”分析结果”面板上选择ID打开结果。 导出到电子表格软件。 保存原始数据（识别的所有蛋白质）。 打开电子表格软件文件。这将包含所有已识别的蛋白质。 在电子表格软件文件中，使用”过滤器”功能来筛选”蛋白质 FDR 置信度：组合”在高（列 B）中，”#Unique肽”高于2（列 K），以及其中一个”丰度比”仅空白（列 S到W）。 使用 函数插入用于”p 值”计算的列*TTEST（对照组、实验组、尾部、类型） 插入具有函数的”统计意义”列*IF（p-值<0.05，"显著性"，"NS"） 使用”过滤器”功能筛选”统计意义”，显示”显著性”。结果表明，分析的蛋白质在对照组和实验组具有统计学意义。 与对照组相比，确定实验组中蛋白质表达丰度明显高于或较低，插入具有功能的”调节”列*IF（控制组）>AVERAGE（实验组），”向上管制”，”放松”） 10. 评估重大点击数的方法 要识别 TMT 研究中确定的重要命中之间的蛋白质-蛋白质相互作用，请使用搜索工具检索相互作用的基因/蛋白质 （STRING） 版本 11.021 ：https://string-db.org/ 要按组（即分子功能、生物过程和蛋白质类）分类，请使用蛋白质分析通过进化关系（PANTHER）本体分类软件22：http://www.pantherdb.org/ http://www.pantherdb.org/ 要识别各种途径中的蛋白质相互作用，请使用通路分析软件23。 11. 将蛋白酶数据上载到存储库银行 要将蛋白质组数据提交到蛋白质组学 IDENTicantions 数据库 （PRIDE） 或质谱交互式虚拟环境 （MassIVE） 包括以下信息：峰值列表文件（以标准格式（如 mzXML）处理的频谱文件， mzML，或MGF），结果文件（频谱识别的标准格式，如mzIdentML或mzTab），和原始频谱文件（原始质量谱文件在非标准或仪器特定的格式，如。RAW 文件或 。WIFF 文件）。 要提交，请创建一个帐户，并包含关联和项目详细信息等信息。然后，选择步骤 11.1 中列出的文件并上载它们。 要创建官方数据集，请对这些上载的文件运行提交工作流。注： 提交后，数据集将在存储库库中为私有。使用私有选项，数据仅对授权用户可用。还有两个附加选项：1） 共享数据集，它允许访问日记审阅者和协作者;1） 共享数据集，允许访问日志审阅者和协作者;1） 共享数据集，允许访问日志审阅者和协作者;或 2） 公共数据集，该数据集将显示在公共数据集搜索中。这些存储库的另一个重要功能是能够更新上载的数据并将后续发布与现有数据集相关联。