TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Silveli Suzuki-Hatano; Ang-Chen Tsai; Audrey Daugherty; Christina  A. Pacak

doi:10.3791/60970

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioquímica

إعداد عينة TMT لتقديم مرافق Proteomics وتحليل البيانات اللاحقة

Published: June 08, 2020

doi:

10.3791/60970

Silveli Suzuki-Hatano¹, Ang-Chen Tsai¹, Audrey Daugherty¹, Christina A. Pacak¹

¹Department of Pediatrics,University of Florida

Summary

نحن نقدم بروتوكول وضع العلامات الكتلية المترادفية الأمثل (TMT) الذي يتضمن معلومات مفصلة لكل من الخطوات التالية: استخراج البروتين، والقياس الكمي، وهطول الأمطار، والهضم، ووضع العلامات، والخضوع لمرفق البروتيوميات، وتحليل البيانات.

Abstract

التكنولوجيات البروتينية هي منهجيات قوية يمكن أن تساعد فهمنا لآليات العمل في النظم البيولوجية من خلال توفير رؤية عالمية لتأثير المرض أو العلاج أو أي شرط آخر على البروتيوم ككل. يقدم هذا التقرير بروتوكولًا مفصلًا لاستخراج عينات البروتين وقياسها الكمي وهطول الأمطار والهضم ووضع العلامات عليها وتحليل البيانات اللاحقة لعينات البروتين. يتطلب بروتوكول وضع العلامات الأمثل TMT تركيزًا أقل لعلامة العلامة ويحقق بيانات موثوقة باستمرار. لقد استخدمنا هذا البروتوكول لتقييم ملامح التعبير البروتين في مجموعة متنوعة من أنسجة الماوس (أي القلب والعضلات والهيكل العظمي والدماغ) وكذلك الخلايا المستزرعة في المختبر. بالإضافة إلى ذلك، نوضح كيفية تقييم آلاف البروتينات من مجموعة البيانات الناتجة.

Introduction

تم تعريف مصطلح “البروتيوميك” لأول مرة على أنه التوصيف الواسع النطاق لمكمل البروتين بأكمله للخلية أو الأنسجة أو الكائن الحي^1. تمكن التحليلات البروتينية من التحقيق في الآليات والعمليات الخلوية التي ينطوي عليها تطور الأمراض ، والمسارات العلاجية ، والنظم الصحية باستخدام تقنيات لأداء كمية نسبية من مستويات التعبير^{البروتين2}. نشرت الأوصاف الأولية لهذه الدراسات في عام 1975 وأظهرت استخدام ثنائي الأبعاد البولياكريلاميد هلام electrophoresis (2D-PAGE) لهذا الغرض¹^,³. الأسلوب 2D يفصل بين البروتينات على أساس الشحن (isoelectric التركيز، IEF) والكتلة الجزيئية (الصوديوم dodecyl كبريتات polyacrylamide هلام electrophoresis، أو SDS-PAGE)⁴. لسنوات، كان الجمع بين 2D-PAGE والطيف الكتلي الترادفي اللاحق الذي تم إجراؤه على كل مكون هلامي هو تقنية تحليل التعبير البروتيني غير المستهدفالأكثر شيوعًا التي تم تنفيذها وتحديد العديد من ملفات تعريف التعبير البروتيني غير المعروفة^سابقًا⁵،⁶. العيوب العامة لنهج 2D-PAGE هي أنه يستغرق وقتا طويلا، لا يعمل بشكل جيد للبروتينات الكارهة للماء، وهناك قيود في العدد الإجمالي للبروتينات التي تم تقييمها بسبب انخفاض الحساسية⁷^،⁸.

أصبح وضع العلامات النظائر مستقرة من الأحماض الأمينية في ثقافة الخلية (SILAC) الأسلوب شعبية المقبل لتحديد وقياس وفرة البروتين في عينات⁹. وهو يتألف من العلامات الأيضية للخلايا التي يتم احتضانها في المتوسط تفتقر إلى الأحماض الأمينية الأساسية القياسية وتستكمل مع نسخة تحمل اسم النظائر من تلك الأحماض الأمينية محددة¹⁰. ميزة هذه التقنية هي كفاءتها وأدق وضع العلامات⁹. القيد الرئيسي لنهج SILAC هو في المقام الأول انخفاض معدل نمو الخلايا الناجم عن دمج تسمية النظائر ، والتي يمكن أن تكون صعبة بشكل خاص في خطوط الخلايا الحساسة نسبيًا التي تشكل الأمراض البشرية¹¹.

في عام 2003، تم إدخال تقنية البروتيوميات الجديدة والقوية التي تنطوي على علامات isobaric العلامة الجماعية جنبا إلى جنب (TMT) إلى الميدان¹². TMT وضع العلامات هو وسيلة قوية بسبب زيادة حساسيته للكشف عن مستويات التعبير البروتين النسبي والتعديلات ما بعد الترجمة¹³. اعتبارا من تاريخ هذا النشر، تم تطوير مجموعات TMT التي يمكن أن التسمية في وقت واحد 6، 10، 11، أو 16 عينات. ونتيجة لذلك، فمن الممكن لقياس وفرة الببتيد في ظروف متعددة مع يكرر البيولوجية في نفس الوقت¹⁴^،¹⁵^،^16. استخدمنا مؤخرا TMT لتوصيف الشخصية القلبية البروتينية لنموذج الماوس من متلازمة بارث (BTHS)¹⁷. وبذلك، تمكنا من إظهار تحسن واسع النطاق في الملامح القلبية لفئران BTHS التي عولجت بالعلاج الجيني وتحديد البروتينات الجديدة التي تأثرت بـ BTHS التي كشفت عن مسارات علاجية جديدة تشارك في اعتلال عضلة القلب.

هنا، نحن نصف طريقة مفصلة لإجراء تحليلات متعددة TMT البروتيوميك الكمية باستخدام عينات الأنسجة أو كريات الخلية. يمكن أن يكون من المفيد إجراء إعداد العينة ووضع العلامات قبل تقديمها إلى النواة لأن الببتيدات التربتيك المسمى أكثر استقرارًا من العينات المجمدة الخام ، وليس كل النوى لديها خبرة في التعامل مع جميع أنواع العينات ، ويمكن إعداد العينات في المختبر توفير الوقت للنوى ، والتي غالبًا ما تكون لها تراكمات طويلة. للحصول على وصف مفصل للجزء الطيفي الشامل من هذه العملية يرجى الاطلاع على كيرشنباوم وآخرون وبيرومال وآخرون^18،^,¹⁹.

يتكون بروتوكول إعداد العينة من الخطوات الرئيسية التالية: الاستخراج، القياس الكمي، هطول الأمطار، الهضم، ووضع العلامات. الفوائد الرئيسية لهذا البروتوكول الأمثل هي أنه يقلل من تكاليف وضع العلامات ، ويحسن استخراج البروتين ، ويولد باستمرار بيانات عالية الجودة. بالإضافة إلى ذلك، نحن نصف كيفية تحليل بيانات TMT لفحص الآلاف من البروتينات في فترة قصيرة من الزمن. ونأمل أن يشجع هذا البروتوكول مجموعات البحوث الأخرى على النظر في إدراج هذه المنهجية القوية في دراساتها.

Protocol

وافقت لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها من جامعة فلوريدا على جميع الدراسات الحيوانية. 1- إعداد الكواشف إعداد CHAPS Lysis المخزن المؤقت (150 mM KCl، 50 mM HEPES pH = 7.4، 0.1٪ CHAPS، و1 قرص كوكتيل مثبط بروتياز لكل 50 مل من المخزن المؤقت). يمكن تخزين المخزن ة المؤقتة دون مثبطات البروتياز في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر أو عازلة مع مثبطات البروتياز المخزنة في -20 درجة مئوية تصل إلى 1 سنة. إعداد بيكربونات ثلاثي ة الماتر (TEAB) على سعة 100 متر متر مربع( TEAB): أضف 500 ميكرولتر من 1 M TEAB إلى 4.5 مل من الماء فائق النقاء. إعداد 200 mM تريس (2-carboxyethyl) فوسفين هيدروكلوريد (TCEP): إضافة 70 ميكرولتر من 0.5 M TCEP، كاشف ديناتورنج، إلى 70 ميكرولتر من المياه فائقة النقاء. ثم أضف 35 ميكرولتر من 1 M TEAB. إعداد 5٪ هيدروكسيلامين: إضافة 50 ميكرولتر من 50٪ هيدروكسيلامين إلى 450 ميكرولتر من 100 mM TEAB. 2. استخراج البروتين عزل العضلات رباعية من الماوس القتل الرحيم وفقا لبروتوكول وافق IACUC. تجميد وصيانة في -80 درجة مئوية أو الاستمرار في البروتوكول للاستخدام الفوري. قطع لعزل ما يقرب من 10 ملغ من أنسجة الماوس رباعية الطازجة أو المجمدة. ألياف منفصلة باستخدام ملاقط عند العمل مع العضلات الهيكلية. بدلاً من ذلك، إذا كان العمل مع ثقافات الخلية، إعادة تعليق ~ 3 × 106 خلايا في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت حل الخلايا CHAPS والانتقال إلى الخطوة 2.4. تجانس الأنسجة باستخدام عامل تعطيل حبة باستخدام 2 أنابيب مل مليئة ما يقرب من 200 ميكرولتر من 1 مم زركونيا / حبات السيليكا و 500 ميكرولتر من العازلة الزل ة CHAPS. توسيع نطاق صعودا أو هبوطا حسب الاقتضاء (على سبيل المثال، 5 ملغ من الأنسجة في 250 ميكرولتر من العازلة الزل ة CHAPS). أداء سونيكيشن (10x لمدة 10 ق مع كل 50٪ السعة و 30 ق فترات على الجليد) لإطلاق البروتين ملزمة للحمض النووي. ويمكن تحقيق نفس نتائج تدهور الحمض النووي إما مع تحلل الحقنة عن طريق تمرير تحلل 10x من خلال إبرة 21 G تعلق على حقنة 1 مل، أو عن طريق حضانة البنزوناز (44 U/mL) في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. الطرد المركزي في lysate في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية ونقل supernatant إلى أنبوب جديد للطرد المركزي. 3- قياس البروتين تحديد تركيز البروتين من supernatant باستخدام البروتوكولات المعمول بها (انظر جدول المواد).ملاحظة: من الأفضل استخدام العينات عند ≥ 2 ميكروغرام/ميكرولتر، ولكن يمكن أيضًا استخدام عينات أقل تركيزًا. إذا تم استخدام عينة أقل تركيزا سيكون من الضروري ضبط أحجام الكواشف الحد / alkylating في الخطوة 5.1 بشكل مناسب. إعداد تخفيف منحنى معيار BSA باستخدام المخزن المؤقت تحليل CHAPS. اتبع تعليمات الشركة المصنعة، وبعد 15 دقيقة، وقراءة امتصاص في 750 نانومتر. 4. الحد من / علاج الكاشف alkylating نقل 200 ميكروغرام من البروتين لكل شرط إلى أنبوب طرد مركزي جديد والتكيف مع حجم نهائي من 100 ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت تحليل CHAPS. من الممكن توسيع نطاق ما يصل إلى 200 ميكرولتر عندما يكون تركيز البروتين منخفضًا جدًا ، ولكن لا تنسى ضبط حجم كاشف تقليل / الكيلات بشكل مناسب. أضف 5 ميكرولتر من 200 mM TCEP وعينات الاحتضان في 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. قبل الاستخدام مباشرة، قم بإعداد 375 مللي متر يودواتميد عن طريق إذابة أنبوب واحد من اليودواسيتاميد (أي 9 ملغ) إلى 132 ميكرولتر من 100 مليون جنيه من TEAB M. حماية هذا الحل من الضوء. أضف 5 ميكرولتر من 375 مل يودواتميد إلى العينة واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) محمية من الضوء. 5- الميثانول/الكلوروفورم هطول الأمطار20 أضف 400 ميكرولتر من الميثانول إلى كل 100 ميكرولتر من البروتين وعينات دوامة لفترة وجيزة. الطرد المركزي في 9000 × ز ل10 s في RT. هذا هو لدمج السوائل المودعة على جانبي أنبوب العينة. إضافة 100 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى الخليط ودوامة لفترة وجيزة. استخدام 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إذا كانت العينة لديها تركيز عال من الفوسفوليبيدات. الطرد المركزي في 9000 × ز ل10 s في RT. هذا هو لدمج السوائل المودعة على جانبي أنبوب العينة. إضافة 300 ميكرولتر من الماء والدوامة بقوة. من المهم الحصول على حل متجانس. الطرد المركزي في 9000 × ز لمدة دقيقة واحدة في RT. كن حذرا للغاية لتجنب إزعاج الطبقات عند نقل الأنبوب إلى رف.ملاحظة: يجب أن يحتوي الأنبوب الآن على ثلاث مراحل: 1) الطبقة العليا (أي supernatant)، خليط من الماء والميثانول؛ 1) طبقة علوية (أي فوقية)، مزيج من الماء والميثانول؛ 1) طبقة علوية (أي فوقية)، مزيج من الماء والميثانول. 2) الطبقة الوسطى (أي بين الطور)، والبروتين الأبيض المعجل؛ و 3) الطبقة السفلية (أي المرحلة السفلية)، الكلوروفورم. إزالة بعناية supernatant. إضافة 300 ميكرولتر من الميثانول إلى المرحلة المتبقية بين الطور وأسفل. دوامة بقوة. الطرد المركزي في 9000 × ز لمدة 2 دقيقة في RT. كن حذرا للغاية لتجنب إزعاج الطبقات عند نقل الأنبوب إلى رف. إزالة بعناية supernatant. بلطف تستنشق أكبر قدر ممكن من السائل تحت تيار من الهواء (على سبيل المثال، باستخدام مكثف فراغ) في RT حتى بيليه هو مجرد رطبة بعض الشيء (~ 10 دقيقة). كما قد يكون الوقت اللازم مختلفة لكل عينة، والتحقق من كل 2 دقيقة لتقييم. تخزين بيليه في -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة. 6. هضم البروتين إعادة تعليق بيليه البروتين المعجل في 100 ميكرولتر من العازلة تحليل TEAB.ملاحظة: من الاختياري قياس تركيز البروتين في هذه الخطوة. قبل الاستخدام مباشرة، قم بإعداد 1 ميكروغرام/ميكرولتر التربسين بإضافة 100 ميكرولتر من محلول تخزين التربسين (50 مأ حمض الخليك) إلى الجزء السفلي من قارورة الزجاج 100 ميكروغرام التربسين واحتضان لمدة 5 دقائق في RT. مخزن الكاشف المتبقي في جرعات ذات استخدام واحد في -80 درجة مئوية. أضف 2.5 ميكرولتر من التربسين لكل 100 ميكروغرام من البروتين. هضم العينة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. هذه الخطوة حاسمة للذوبان الكامل للبروتين. لا تقم بتعديل هذه الشروط. بعد الهضم ، من الاختياري قياس تركيز البروتين باستخدام المقاييس البروتينية القياسية. 7. الببتيد وضع العلامات قبل الاستخدام مباشرة، قم بمعادلة كواشف مجموعة ملصقات TMT إلى RT. حل كل من 0.8 ملغ TMT قارورة العلامة من خلال إضافة 41 ميكرولتر من الأسيتونتريل اللامائي إلى كل أنبوب. احتضان كاشف لمدة 5 دقيقة في RT مع الدوامة في بعض الأحيان. طرد مركزي لفترة وجيزة الأنابيب.ملاحظة: تركيز 0.8 ملغ من علامة TMT عادة ما يكون كافيا لتسمية مجموعتين. غير أن محققين آخرين أثبتوا أن هذا التركيز يمكن تخفيضه أكثر من ذلك ولا يزال يسفر عن بيانات موثوقة15. أضف بعناية 41 ميكرولتر من كاشف تسمية TMT إلى كل عينة 100 ميكرولتر. احتضان رد الفعل لمدة 1 ساعة في RT. إضافة 8 ميكرولتر من 5٪ هيدروكسيلامين إلى العينة واحتضان لمدة 15 دقيقة لإرواء رد الفعل. تقسيم العينات إلى كميات متساوية في أنبوب طرد مركزي جديد وتخزينها عند -80 درجة مئوية.ملاحظة: في هذه الخطوة العينات مستقرة ويمكن تقديمها للطياف الشامل. ومن الاختياري لقياس التركيز في هذه المرحلة باستخدام المقاييس البروتين القياسية. 8- التحليل الطيفي الشامل تقديم العينات إلى منشأة proteomics (استخدمت هذه الدراسة مرفق يو إف ICBR Proteomics Core) ، حيث يتم الجمع بين جميع العينات وتنقيتها باستخدام أعمدة الدوران C18.ملاحظة: ناقش مع المرفق الأساسي كيفية تقديم العينات قبل إعدادها لتأكيد الخطوات الدقيقة التي يفضلونها للتقديم. اطلب الإجراءات التالية لكل عينة متعددة مجتمعة: استخراج المرحلة الصلبة ، HPLC (SCX ، SE) ، تلميح الرمز البريدي ، وLC-MS / MS (2 h التدرج لمعرف البروتين ، إذا > 10QE زائد). وبمجرد جمع البيانات، سيقوم المرفق الأساسي بمعالجة ملفات RAW باستخدام البرامج التي يوفرها البائعون لتحديد البروتين. 9 – تحليل البيانات عادة ما يتم تسليم البيانات من النواة مرة أخرى إلى المستخدم في تنسيق 7z، والتي يمكن أن تتطلب ما يقرب من 16 غيغابايت من مساحة القرص لكل مجموعة بيانات (في هذه الحالة 11 عينة). لمعالجة البيانات، تأكد من توفر جهاز كمبيوتر لا يقل عن 3.4 جيجاهرتز. استخراج الملفات باستخدام 7-Zip إدارة الملفات. تحتوي هذه الملفات المستخرجة على بيانات RAW وملف تنسيق pdStudy وملف تنسيق pdResultView. حفظ كافة الملفات لمزيد من التحليلات. فتح ملف باستخدام Proteome ديسكفري 2.2 البرمجيات.ملاحظة: تنسيق الملف هو “ملف name.pdStudy”. إذا تم فتح “اسم الملف.pdResultView” فإنه لا يمكن تحديد عينة التحكم. حدد عينات التحكم على لوحة”العينات”. فتح النتيجة عن طريق تحديد معرف على لوحة”نتائج التحليل”. التصدير إلى برامج جداول البيانات. حفظ البيانات الخام (تم تحديد جميع البروتينات). افتح ملف برنامج جدول البيانات. هذا سوف تحتوي على جميع البروتينات التي تم تحديدها. في ملف برنامج جدول البيانات استخدام”تصفية”وظيفة لفحص “البروتين FDR الثقة: مجتمعة” في ارتفاع (العمود باء)،”#Unique الببتيدات” أعلى من 2 (العمود K)،وإما واحدة من”نسبة وفرة”فارغة حصرا(العمود S تصل إلى W). إدراج عمود لحساب”القيمة ف”مع الدالة= TTEST (مجموعة التحكم، المجموعة التجريبية، الذيول، نوع) إدراج عمود لـ”الأهمية الإحصائية”مع الدالة=IF (p-value<0.05, "أهمية",NS") استخدام”تصفية”وظيفة لفحص”الأهمية الإحصائية”عرض”أهمية”. تظهر النتيجة البروتينات التي تم تحليلها مع الأهمية الإحصائية في مجموعة التحكم والمجموعة التجريبية. تحديد أعلى بكثير أو أقل وفرة التعبير البروتين في المجموعة التجريبية بالمقارنة مع مجموعة التحكم، إدراج عمود لـ “تنظيم”مع وظيفة=IF (AVERAGE (مجموعة التحكم)>AVERAGE (مجموعة تجريبية)، “Upregulationed”,” Downregulationed”) 10- طرق تقييم الزيارات الهامة لتحديد التفاعلات البروتين البروتين بين الزيارات الهامة المحددة في دراسات TMT، استخدم أداة البحث لاسترجاع الجينات/البروتينات المتفاعلة (STRING) الإصدار 11.021: https://string-db.org/ للتصنيف حسب المجموعات (أي الوظيفة الجزيئية والعمليات البيولوجية وفئات البروتين) استخدم تحليل البروتين من خلال العلاقات التطورية (PANTHER) برنامج تصنيف علم الأنطولوجيا22: http://www.pantherdb.org/ لتحديد تفاعلات البروتين في مجموعة متنوعة من المسارات، استخدم برنامج تحليل المسارات23. 11 – تحميل البيانات البروتينية إلى مصرف مستودع لتقديم البيانات البروتينية إلى قاعدة بيانات البروتيوميكس IDEntificantions (PRIDE) أو الكتلة Spectrometry البيئة الافتراضية التفاعلية (MassIVE) تشمل المعلومات التالية: ملفات قائمة الذروة (ملفات الطيف الشامل المعالجة في شكل قياسي مثل mzXML، mzML، أو MGF)، وملفات النتائج (تحديد الطيف في شكل قياسي مثل mzIdentML أو mzTab)، وملفات الطيف الخام (ملفات الطيف الشامل الخام في شكل غير قياسي أو أداة محددة مثل. ملفات RAW أو . ملفات WIFF). لإرسال حساب وإنشاء حساب وتضمين معلومات مثل الانتماء وتفاصيل المشروع. ثم حدد الملفات المذكورة في الخطوة 11.1 وتحميلها. لإنشاء مجموعة بيانات رسمية، قم بتشغيل سير عمل إرسال على هذه الملفات التي تم تحميلها.ملاحظة: بعد الإرسال، ستكون مجموعة البيانات خاصة في بنك المستودع. مع الخيار الخاص، تتوفر البيانات فقط للمستخدمين المعتمدين. هناك خياران إضافيان: 1) مجموعة بيانات مشتركة، والتي تتيح الوصول إلى مراجعي المجلات والمتعاونين معها؛ (2) مجموعة البيانات المشتركة، التي تتيح الوصول إلى مراجعي المجلات والمتعاونين معها. أو 2) مجموعة البيانات العامة، والتي سوف تظهر في عمليات البحث في مجموعة البيانات العامة. ومن السمات الهامة الأخرى لهذه المستودعات القدرة على تحديث البيانات التي تم تحميلها وربط المنشورات اللاحقة بمجموعة البيانات القائمة.

Representative Results

تم تحليل الخلايا الصحية والمرضية في عازل CHAPS ، تم إعدادها كما هو مفصل في طريقة وضع العلامات TMT ، وقدمت إلى مركز جامعة فلوريدا متعدد التخصصات لأبحاث التكنولوجيا الحيوية (UF-ICBR) Core للكروماتوغرافيا السائلة مع قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب. بعد الحصول على البيانات وتسليمها من النواة ، تم فتح مجموعة البيانات في البرامج التي يوفرها البائع وتم تطبيق مرشحات القطع التالية: ≥ 2 الببتيدات الفريدة ، وions المراسل لكل عينة بروتين موجودة في جميع القنوات ، وتشمل فقط البروتينات المعدلة بشكل كبير (p ≤ 0.05). ويلخص الجدول 1 البيانات: 653 39 ببتيدات إجمالية، منها 211 7 بتيدات فريدة أو أكبر من اثنين من الببتيدات الفريدة، و829 3 منها تتضمن أيونمراسل لجميع القنوات. تم حساب قيم p لهذه الببتيدات 3,829 بواسطة اختبار الطالب لا و p ≤ 0.05 تعتبر كبيرة. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام قطع تغيير أضعاف لتحديد التوزيع النسبي للبروتينات من المرضى مقارنة بالخلايا السليمة: أسفل تنظيم (الأزرق) أو upregulationed (الأحمر)(الشكل 1). تم تقييم قائمة التعبير البروتيني المنقّب إلى حد كبير باستخدام نظام تصنيف علم الأنطولوجيا PANTHER وتحليلات STRING. وأظهرت تحليلات الفهود قائمة مصنفة من البروتينات على أساس أقل بكثير(الشكل 2A)أو وفرة أعلى في الخلايا المريضة على أساس وظيفة الجزيئية(الشكل 2B). التحليلات سلسلة من البروتينات من أقل بكثير(الشكل 2C)وأعلى(الشكل 2D)وفرة حددت تفاعلات متعددة وروابط قوية بين البروتينات. الشكل 1: مؤامرة بركان عرض البروتينات التي لم تتغير وفرة بشكل كبير (أسود)، خفضت بشكل كبير (الأزرق)، أو زيادة كبيرة (الأحمر) في خلايا السيطرة المريضة مقابل السليمة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: تقييمات تمثيلية للضربات المندرجة في التنظيم بشكل كبير التي حددها PANTHER (A و B) والسلسلة (C, D) من بروتينات الوفرة الأقل أو الأعلى بكثير. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. مجموع الببتيدات المجموع المحدد ≥ 2 الببتيدات فريدة من نوعها البروتينات الكمية البروتينات المتغيرة بشكل كبير منخفضه عاليه 39653 7211 4457 3829 296 108 الجدول 1: جدول تمثيلي للبروتينات الكمية لكل تحليل لمجموعة البيانات.

Discussion

لإعداد عينات بنجاح لتحليل البروتينات باستخدام منهجيات تسمية النظائر المستقرة النظيرية المستندة إلى TMT ، من الضروري إجراء عمليات استخراج البروتين بعناية فائقة عند 4 درجة مئوية واستخدام عازل التحلل الذي يحتوي على كوكتيل مثبط بروتياز²⁴^،²⁵. كوكتيل مثبطات البروتياز هو كاشف حاسم لتجنب تدهور البروتين غير متوقع أثناء هضم البروتين. أحد الفرق الرئيسي بين بروتوكولنا والبروتوكول الحالي الذي يقدمه البائع هو أننا نوصي بشدة باستخدام المخزن المؤقت لـ CHAPS lysis استنادًا إلى خبرتنا مع خلايا الثدييات والأنسجة. نقترح أيضا استخدام نهج هطول الأمطار البروتين الميثانول / الكلوروفورم لكل من كريات الخلية والأنسجة.

ومن الناحية المثالية، يتم إجراء استخراج البروتين، والقياس، والحد من / العلاجات الكاشف اتلاق، والميثانول / الكلوروفورم هطول الأمطار في نفس اليوم. بعد هذه التوصية سيؤدي إلى تركيزات بروتين أكثر دقة للوسم اللاحقة. خطوة هطول الأمطار البروتين مهم لإزالة الكواشف التي من شأنها أن تتداخل مع الطيف الكتلي جنبا إلى جنب. بما في ذلك خطوة هطول الأمطار يعزز بشكل كبير قرار TMT²⁶. باختصار ، تتمثل المزايا الرئيسية لبروتوكول TMT لدينا في كفاءة وضع العلامات العالية لأنواع مختلفة من العينات ، واستنساخها ، والبيانات الموثوقة المكتسبة.

مع استمرار اتساع الطبيعة المتعددة لاستراتيجية البروتيوميات غير المستهدفة TMT هذه ، فإنها ستعزز تدريجيا قدرة الباحثين عبر مجموعة واسعة من المجالات على تحقيق اكتشافات جديدة. على وجه التحديد في مجال الطب الحيوي ، وجدنا نحن وآخرون هذه التكنولوجيا غنية بالمعلومات بشكل متزايد في الدراسات التي تستكشف آليات جديدة للعمل في الأمراض والآثار النسبية لمختلف العلاجات. ولكل هذه الأسباب، تكمل هذه التكنولوجيا القوية ذخيرة نهج OMICS الأخرى المستخدمة في الدراسات البحثية الحديثة وتوفر معلومات رئيسية يمكن أن توجه المزيد من التطوير العلاجي.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نود أن نعترف مرفق البروتيوميات UF-ICBR لتجهيزها عيناتلدينا. وقد دعم هذا العمل جزئياالمعاهد الوطنية للصحة R01 HL136759-01A1 (CAP).

Materials

1 M Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 50 mL	Thermo Fisher	90114	Reagent for protein labeling
50% Hydroxylamine, 5 mL	Thermo Fisher	90115	Reagent for protein labeling
Acetic acid	Sigma	A6283	Reagent for protein digestion
Anhydrous acetonitrile, LC-MS Grade	Thermo Fisher	51101	Reagent for protein labeling
Benzonaze nuclease	Sigma-Aldrich	E1014	DNA shearing
Bond-Breaker TCEP solution, 5 mL	Thermo Fisher	77720	Reagent for protein labeling
BSA standard	Thermo	23209	Reagent for protein measurement
CHAPS	Thermo Fisher	28300	Reagent for protein extraction
Chloroform	Fisher	BP1145-1	Reagent for protein precipitation
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablet	Roche	4693132001	Reagent for protein extraction
DC Protein Assay	BioRad	500-0116	Reagent for protein measurement
Excel	Microsoft Office		Software for data analyses
Heat block	VWR analog	12621-104	Equipment for protein digestion incubation
HEPES	Sigma	RDD002	Reagent for protein extraction
Methanol	Fisher	A452-4	Reagent for protein precipitation
Pierce Trypsin Protease, MS Grade	Thermo Fisher	90058	Reagent for protein digestion
Potassium chloride	Sigma	46436	Reagent for protein extraction
Sigma Plot 14.0	Sigma Plot 14.0		Software for data analyses
Sonicator	Fisher Scientific	FB120	DNA shearing
Spectra Max i3x Multi-Mode Detection Platform	Molecular Devices		Plate reader for protein measurement
Thermo Scientific Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay	Thermo Fisher	23275	Reagent for protein measurement
Thermo Scientific Pierce Quantitative Fluorescent Peptide Assay	Thermo Fisher	23290	Reagent for protein measurement
Thermo Scientific Proteome Discoverer Software	Thermo Fisher	OPTON-30945	Software for data analyses
TMT 10plex Isobaric Label Reagent Set 0.8 mg, sufficient reagents for one 10plex isobaric experiment	Thermo Fisher	90110	Reagent for protein labeling
TMT11-131C Label Reagent 5 mg	Thermo Fisher	A34807	Reagent for protein labeling
Water, LC-MS Grade	Thermo Fisher	51140	Reagent for protein extraction

Referências

Graves, P. R., Haystead, T. A. Molecular biologist’s guide to proteomics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (1), 39-63 (2002).
Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample Preparation for Relative Quantitation of Proteins Using Tandem Mass Tags (TMT) and Mass Spectrometry (MS). Methods in Molecular Biology. 1741, 135-149 (2018).
O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. Journal of Biological Chemistry. 250 (10), 4007-4021 (1975).
Rabilloud, T., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: a tutorial. Journal of Proteomics. 74 (10), 1829-1841 (2011).
Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
Anderson, N. G., Anderson, N. L. Twenty years of two-dimensional electrophoresis: Past, present and future. Electrophoresis. 17 (3), 443-453 (1996).
Haynes, P. A., Yates, J. R. Proteome profiling-pitfalls and progress. Yeast. 17 (2), 81-87 (2000).
Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 815 (1-2), 227-236 (2005).
Sury, M. D., Chen, J. X., Selbach, M. The SILAC fly allows for accurate protein quantification in vivo. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (10), 2173-2183 (2010).
Zhang, G., Neubert, T. A. Use of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) for phosphotyrosine protein identification and quantitation. Methods in Molecular Biology. 527, 79-92 (2009).
Wang, X., et al. SILAC-based quantitative MS approach for real-time recording protein-mediated cell-cell interactions. Scientific Reports. 8 (1), 8441 (2018).
Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).
Cheng, L., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. Peptide Labeling Using Isobaric Tagging Reagents for Quantitative Phosphoproteomics. Methods in Molecular Biology. 1355, 53-70 (2016).
Navarrete-Perea, J., Yu, Q., Gygi, S. P., Paulo, J. A. Streamlined Tandem Mass Tag (SL-TMT) Protocol: An Efficient Strategy for Quantitative (Phospho)proteome Profiling Using Tandem Mass Tag-Synchronous Precursor Selection-MS3. Journal of Proteome Research. 17 (6), 2226-2236 (2018).
Zecha, J., et al. TMT Labeling for the Masses: A Robust and Cost-efficient, In-solution Labeling Approach. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).
Bachor, R., Waliczek, M., Stefanowicz, P., Szewczuk, Z. Trends in the Design of New Isobaric Labeling Reagents for Quantitative Proteomics. Molecules. 24 (4), E701 (2019).
Suzuki-Hatano, S., et al. AAV9-TAZ Gene Replacement Ameliorates Cardiac TMT Proteomic Profiles in a Mouse Model of Barth Syndrome. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 13, 167-179 (2019).
Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (40), e1954 (2010).
Perumal, N., et al. Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels. Journal of Visualized Experiments. (144), e59140 (2019).
Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138, 141-143 (1984).
Jensen, L. J., et al. STRING 8–a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms. Nucleic Acids Research. 37, D412-D416 (2009).
Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).
Cirillo, E., Parnell, L. D., Evelo, C. T. A Review of Pathway-Based Analysis Tools That Visualize Genetic Variants. Frontiers in Genetics. 8, 174 (2017).
Plaxton, W. C. Avoiding Proteolysis during the Extraction and Purification of Active Plant Enzymes. Plant and Cell Physiology. 60 (4), 715-724 (2019).
Ryan, B. J., Henehan, G. T., Walls, D., Loughran, S. T. . Protein Chromatography: Methods and Protocols. , 53-69 (2017).
Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artigo

Suzuki-Hatano, S., Tsai, A., Daugherty, A., Pacak, C. A. TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis. J. Vis. Exp. (160), e60970, doi:10.3791/60970 (2020).