Abordagem estereotática angular adaptável para técnicas versáteis de neurociência
Summary
Descrito aqui é um procedimento estereotático que pode atingir regiões cerebrais desafiadoras e de difícil acesso (devido a limitações espaciais) usando uma abordagem coronal angular. Este protocolo é adaptável tanto aos modelos de camundongos quanto a ratos e pode ser aplicado a diversas aplicações neurocientíficas, incluindo implantação de cânulas e microinjeções de construções virais.
Abstract
A cirurgia estereotática é uma ferramenta essencial no laboratório de neurociência moderno. No entanto, a capacidade de atingir com precisão e precisão regiões cerebrais de difícil acesso ainda apresenta um desafio, particularmente quando se mira estruturas cerebrais ao longo da linha média. Esses desafios incluem evitar o seio sagital superior e o terceiro ventrículo e a capacidade de atingir consistentemente núcleos cerebrais seletivos e discretos. Além disso, técnicas de neurociência mais avançadas (por exemplo, optogenética, fotometria de fibras e imagem de dois fótons) dependem da implantação direcionada de hardware significativo para o cérebro, e limitações espaciais são um obstáculo comum. Apresentado aqui é um protocolo modificável para alvo estereotático de estruturas cerebrais de roedores usando uma abordagem coronal angular. Pode ser adaptado para 1) modelos de camundongos ou ratos, 2) várias técnicas de neurociência e 3) múltiplas regiões cerebrais. Como exemplo representativo, inclui o cálculo de coordenadas estereotáticas para direcionamento do núcleo ventromedial hipotalâmico do camundongo (VMN) para um experimento de inibição optogenética. Este procedimento começa com a microinjeção bilateral de um vírus associado ao adeno (AAV) codificando um canal de cloreto sensível à luz (SwiChR++) a um modelo de rato dependente de Cre, seguido pela implantação bilateral em ângulo de cânulas de fibra óptica. Usando essa abordagem, os achados mostram que a ativação de um subconjunto de neurônios VMN é necessária para respostas contra-regulatórias de glicose intactas à hipoglicemia induzida pela insulina.
Introduction
O controle neural do comportamento, da alimentação e do metabolismo envolve a coordenação de neurocircuitos altamente complexos, integrativos e redundantes. Um objetivo do campo da neurociência é dissecar a relação entre estrutura de circuito neuronal e função. Embora as ferramentas clássicas de neurociência (ou seja, lesões, injeções farmacológicas locais e estimulação elétrica) tenham descoberto conhecimentos vitais sobre o papel de regiões cerebrais específicas que controlam o comportamento e o metabolismo, essas ferramentas são limitadas pela falta de especificidade e reversibilidade1.
Os recentes avanços no campo da neurociência melhoraram muito a capacidade de interrogar e manipular a função do circuito de forma específica do tipo celular com alta resolução espacial. Abordagens optogenéticas2 equimiogenética 3, por exemplo, permitem a manipulação rápida e reversível da atividade em tipos celulares geneticamente definidos de animais em movimento livre. A optogenética envolve o uso de canais de íons sensíveis à luz, denominados channelrhodopsins, para controlar a atividade neuronal. A chave para esta técnica é a entrega genética de channelrhodopsin e uma fonte de luz para ativar a opsina. Uma estratégia comum para a entrega de genes é através de uma combinação de 1) camundongos geneticamente modificados expressando Cre-recombinase em neurônios discretos, e 2) vetores virais dependentes de Cre codificando channelrhodopsin.
Embora a optogenética forneça um meio elegante e altamente preciso para controlar a atividade neuronal, o método depende da microinjeção estereotática bem sucedida do vetor viral e da colocação fibra óptica em uma região cerebral definida. Embora os procedimentos estereotáticos sejam comuns dentro do moderno laboratório de neurociência (e existem vários protocolos excelentes descrevendo este procedimento)4,5,6, ser capaz de atingir de forma consistente e reprodutivelmente regiões cerebrais discretas ao longo da linha média (ou seja, o hipotálamo mediobasal, uma área cerebral crítica à regulação das funções homeostáticas7) apresenta desafios adicionais. Esses desafios incluem evitar o seio sagital superior, terceiro ventrículo e núcleos hipotalâmicos adjacentes. Além disso, há limitações espaciais significativas para a implantação bilateral de hardware que é necessária para estudos de inibição. Com esses desafios em mente, este protocolo aqui apresenta um procedimento modificável para atingir regiões cerebrais discretas através de uma abordagem estereática angular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os recentes avanços na neurociência têm apoiado a visão avançada e a compreensão sobre a atividade e a função dos neurociruques cerebrais. Isso inclui a aplicação de tecnologias optogenéticas e quimiéticas para ativar ou silenciar populações neuronais discretas e seus locais de projeção in vivo. Mais recentemente, isso incluiu o desenvolvimento de indicadores de cálcio geneticamente codificados (por exemplo, GCaMP, RCaMP) e outros biosensores fluorométricos (por exemplo, dopamina, norepinefrina) para o …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (NIDDK) concede F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M.), um American Diabetes Association Innovative Basic Science Award (#1-19-IBS-192 para G.J.M.) e o Centro de Pesquisa em Obesidade Nutricional financiado pelo NIDDK (DK-035816), O Centro de Pesquisa em Diabetes (DK-017047) e diabetes, Treinamento de obesidade e metabolismo Grant T32 DK0007247 (T.H.M) na Universidade de Washington.
Materials
| Fiberoptic Cannulae | Doric Lenses | MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT | Customizable |
| Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System | Kopf | Model 1900 | |
| Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge | Kopf | Model 1900-51 | |
| Kopf Model 1905 Alignment Indicator | Kopf | Model 1905 | |
| Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1911 | |
| Kopf Model 1915 Centering Scope | Kopf | Model 1915 | |
| Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 1922 | |
| Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 1923-B | |
| Kopf Model 1940 Micro Manipulator | Kopf | Model 1940 | |
| Micro4 Microinjection System | World Precision Instruments | — | |
| Mouse bone screws | Plastics One | 00-96 X 1/16 | |
| Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule | Thor Labs | XCL | |
| Surgical Drill | Cell Point Scientific | Ideal Micro Drill |
Referências
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