Summary

Approccio stereotassico angolato adattabile per tecniche di neuroscienze versatili

Published: May 07, 2020
doi:

Summary

Qui è descritta una procedura stereotassica che può colpire regioni cerebrali impegnative e difficili da raggiungere (a causa di limitazioni spaziali) utilizzando un approccio coronale angolato. Questo protocollo è adattabile sia a modelli murini che di ratto e può essere applicato a diverse applicazioni neuroscientifiche, tra cui l’impianto di cannule e microiniezioni di costrutti virali.

Abstract

La chirurgia stereotassica è uno strumento essenziale nel moderno laboratorio di neuroscienze. Tuttavia, la capacità di indirizzare in modo preciso e preciso le regioni cerebrali difficili da raggiungere rappresenta ancora una sfida, in particolare quando si prendono di mira le strutture cerebrali lungo la linea mediana. Queste sfide includono l’evitamento del seno sagittale superiore e del terzo ventricolo e la capacità di colpire costantemente nuclei cerebrali selettivi e discreti. Inoltre, le tecniche di neuroscienza più avanzate (ad esempio, optogenetica, fotometria delle fibre e imaging a due fotoni) si basano sull’impianto mirato di hardware significativo al cervello e le limitazioni spaziali sono un ostacolo comune. Qui viene presentato un protocollo modificabile per il targeting stereotassico delle strutture cerebrali dei roditori utilizzando un approccio coronale angolato. Può essere adattato a 1) modelli di topi o ratti, 2) varie tecniche di neuroscienza e 3) più regioni del cervello. Come esempio rappresentativo, include il calcolo delle coordinate stereotassica per il targeting del nucleo ventromediale ipotalamico di topo (VMN) per un esperimento di inibizione optogenetica. Questa procedura inizia con la microiniezione bilaterale di un virus adeno-associato (AAV) che codifica un canale del cloruro sensibile alla luce (SwiChR ++) in un modello murino Cre-dipendente, seguito dall’impianto bilaterale angolato di cannule in fibra ottica. Utilizzando questo approccio, i risultati mostrano che l’attivazione di un sottoinsieme di neuroni VMN è necessaria per le risposte controregolatorie del glucosio intatte all’ipoglicemia indotta dall’insulina.

Introduction

Il controllo neurale del comportamento, dell’alimentazione e del metabolismo comporta il coordinamento di neurocircuiti altamente complessi, integrativi e ridondanti. Un obiettivo trainante del campo delle neuroscienze è quello di sezionare la relazione tra struttura e funzione del circuito neuronale. Sebbene gli strumenti classici delle neuroscienze (ad esempio, lesioni, iniezioni farmacologiche locali e stimolazione elettrica) abbiano scoperto conoscenze vitali riguardanti il ruolo di specifiche regioni del cervello che controllano il comportamento e il metabolismo, questi strumenti sono limitati dalla loro mancanza di specificità e reversibilità1.

I recenti progressi nel campo delle neuroscienze hanno notevolmente migliorato la capacità di interrogare e manipolare la funzione del circuito in un modo specifico di tipo cellulare con un’alta risoluzione spaziotemporale. Gli approcci optogenetici2 e chemiogenetici3, ad esempio, consentono la manipolazione rapida e reversibile dell’attività in tipi di cellule geneticamente definiti di animali che si muovono liberamente. L’optogenetica prevede l’uso di canali ionici sensibili alla luce, chiamati channelrhodopsins, per controllare l’attività neuronale. La chiave di questa tecnica è la consegna genica di channelrhodopsin e una fonte di luce per attivare l’opsina. Una strategia comune per la consegna dei geni è attraverso una combinazione di 1) topi geneticamente modificati che esprimono Cre-ricombiinasi in neuroni discreti e 2) vettori virali cre-dipendenti che codificano per la channelrhodopsin.

Mentre l’optogenetica fornisce un mezzo elegante e altamente preciso per controllare l’attività neuronale, il metodo è subordinato al successo della microiniezione stereotassica del vettore virale e del posizionamento delle fibre ottiche in una regione cerebrale definita. Sebbene le procedure stereotassica siano comuni all’interno del moderno laboratorio di neuroscienze (e ci sono diversi protocolli eccellenti che descrivono questa procedura)4,5,6, essere in grado di indirizzare in modo coerente e riproducibile regioni cerebrali discrete lungo la linea mediana (cioè l’ipotalamo mediobasale, un’area cerebrale critica per la regolazione delle funzioni omeostatiche7) presenta ulteriori sfide. Queste sfide includono l’evitare il seno sagittale superiore, il terzo ventricolo e i nuclei ipotalamici adiacenti. Inoltre, ci sono significative limitazioni spaziali all’impianto bilaterale di hardware che è necessario per gli studi di inibizione. Con queste sfide in mente, questo protocollo qui presenta una procedura modificabile per il targeting di regioni cerebrali discrete attraverso un approccio stereotassico angolato.

Protocol

Tutte le procedure sono state approvate in conformità con il National Institutes of Health, la Guida per la cura e l’uso degli animali e sono state approvate sia dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) che dalla Environmental Health and Safety dell’Università di Washington. 1. Calcolo delle coordinate angolate Usando un atlante cerebrale coronale, segna un triangolo rettangolo in modo che l’ipoteno passi attraverso la regione target di interesse. Nell’esempio rappr…

Representative Results

Questo protocollo descrive una procedura chirurgica per l’esecuzione di studi optogenetici per interrogare il ruolo dei neuroni VMN ipotalamici nel controllo glicemico9. Il primo utilizzo è stato un approccio stereotassico standard (non angolato) per la microiniezione bilaterale di un virus inibitorio channelrhodopsin al VMN. Mentre un approccio angolato sarebbe anche adatto, l’approccio standard (non angolato) è stato scelto perché è sufficiente per indirizzare la regione del cervello di inte…

Discussion

I recenti progressi nelle neuroscienze hanno supportato l’intuizione avanzata e la comprensione dell’attività e della funzione dei neurocircuiti cerebrali. Ciò include l’applicazione di tecnologie optogenetiche e chemiogenetiche per attivare o silenziare popolazioni neuronali discrete e i loro siti di proiezione in vivo. Più recentemente, questo ha incluso lo sviluppo di indicatori di calcio geneticamente codificati (ad esempio, GCaMP, RCaMP) e altri biosensori fluorometrici (ad esempio, dopamina, noradrenalina) per l…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) concede F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M.), un American Diabetes Association Innovative Basic Science Award (#1-19-IBS-192 a G.J.M.) e il Nutrition Obesity Research Center (DK-035816), Diabetes Research Center (DK-017047) e Diabetes, Obesity and Metabolism Training Grant T32 DK0007247 (T.H.M) presso l’Università di Washington.

Materials

Fiberoptic Cannulae Doric Lenses MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT Customizable
Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System Kopf Model 1900
Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge Kopf Model 1900-51
Kopf Model 1905 Alignment Indicator Kopf Model 1905
Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill Kopf Model 1911
Kopf Model 1915 Centering Scope Kopf Model 1915
Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars Kopf Model 1922
Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder Kopf Model 1923-B
Kopf Model 1940 Micro Manipulator Kopf Model 1940
Micro4 Microinjection System World Precision Instruments
Mouse bone screws Plastics One 00-96 X 1/16
Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule Thor Labs XCL
Surgical Drill Cell Point Scientific Ideal Micro Drill

Referências

  1. King, B. M. The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight. Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  3. Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89, 683-694 (2016).
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  5. Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. , e53783 (2016).
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  9. Faber, C. L., et al. Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects. Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).
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Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques. J. Vis. Exp. (159), e60965, doi:10.3791/60965 (2020).

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