Hücre İçi Hızlı Fotokimyasal Oksidasyon ile Hücresel Proteinlerin Karakterizasyonu

1. IC-FPOP akış sistemi kurmak Akış sisteminin montajına başlamak için, erimiş silikayı bir dekolte taşı kullanarak kesin. IC-FPOP akış sistemi, 450 μm ve dış çapı (OD) 670 m, iki 24 cm ve 75 μm kimlikli bir 40 cm ve 360 μm’lik bir OD ile dört adet 12 cm ve bir adet 17 cm erimiş silika (ID) gerektirir. , ve son olarak 150 μm kimliği ve 360 μm bir OD ile iki 57 cm.NOT: Silika boruyu keserken poliimid kaplamayı hafifçe kazıyın ve en temiz kesimi elde etmek için bükün. Düz bir kesim olduğundan emin olun (bu hiçbir tıkanıklık veya sızıntı formu sağlamak için gereklidir). Nano-sıkı kollu (0,0155″ ID X 1/16″ OD 360 μm OD silika boru ve 0,027″ ID X 1/16″ OD 670 μ için m OD silika tüp) süper flangeless somun PEEK 1/4-28 düz alt için 1/16 “OD ve süper flangeless ferrule w / SST halka, Tefzel (ETFE), 1/4-28 düz alt, 1/16” OD için. Üreticiprotokolüne göre bağlantılar oluşturma(Şekil 1). Bir 500 μL şırınga 6 küçük silindirik mıknatıslar yerleştirin. Bu şırıngayı 500 μL şırınga ve iki 5 mL şırınga ile birlikte tamponla doldurun ve havayı çıkarın. Şekil 2A’dagösterildiği gibi şırınga pompası üzerinde pozisyon.NOT: 5 mL şırıngalar 500 μL şırıngalardan daha büyüktür, bu nedenle tüm şırıngaları aynı anda yerinde sıkmak için bir boşluk gereklidir(Şekil 2B). Şırınga pompası durdurucuyu sıkın, böylece hücre şırıngası motor durduğunda yaklaşık 50 μL sola sahiptir. Bu manyetik karıştırıcılar için yer bırakacaktır. (Şekil 2C-D).DİkKAT: Şırınga pompası mıknatıslara baskı yaparsa, şırıngayı bozar ve şırınganın kırılmasına neden olabilir. Luer adaptörü kullanarak, her şırıngaya bir manuel vana bağlayın. Şekil 3’tegösterildiği gibi silika borularını birleştirin.NOT: Hattı hücrelerle (+ H2O2 ile diğer tarafa doğru çapraz dan geçirin. Daha sonra 450 μm ID silika boru içine takın. 5 mL şırıngadaki kılıf tamponları hücrelerden ve H2O2’dendaha hızlı akacak. Her iki tarafta kılıf tamponları ile, hücreler hidrodinamik ışınlama için tek bir satır içine odaklanmış olacaktır. Lazerin yanındaki konum akış sistemi. Bir çakmak kullanarak, lazer ışınlama için bir pencere yapmak için 450 μm ID boru üzerinde silika kaplama yakmak. Altı mıknatısiçeren hücre şırıngası üzerinde bir manyetik karıştırıcı yerleştirin. 1,083.3 μL/dk. Son akış hızı için şırınga pompasını 492,4 μL/dk’ya ayarlayın. Dışbüvek lens kullanarak silika boru üzerine excimer lazer odaklanın. Bir kez odaklanmış, silika boru arkasında küçük bir kağıt parçası yerleştirerek ışınlama penceresi test ve lazer açın. Işınlamadan yanmış bölgeyi ölçün. Sıfır bir dışlama fraksiyonu elde etmek için ışınlama penceresi ve akış hızı kullanarak gerekli lazer frekansını hesaplayın.NOT: IC-FPOP deneyi için önerilen lazer enerjisi ≥120 mJ’dir. 2,58 mm’lik ışınlama penceresi ve 1083,3 μL/dk akış hızı ile 0’ın dışlanma kısmını elde etmek için frekansın 44 olması gerekir. Işınlama penceresi, akış hızı ve dışlama fraksiyonu biliniyorsa, lazer frekansını hesaplamak için gereken denklemler aşağıda verilmiştir.w nL’de hacim, x mm’deki lazer nokta genişliği, y μm’deki silika boru kimliği, v μL’deki toplam hacim, b dışlama fraksiyonu, a μL/dk’daki akış hızı, f ise Hz.’deki frekanstır. 2. Söndürme ve H2O2 olun 100 mM N-tert-Butil-alfa-fenilnitron (PBN) ve 100 mM N,N’-dimethylthiourea (DMTU) içeren söndürme yapın. Aliquot her numune için 50 mL konik bir tüp içine 11 mL söndürme. Seyreltik H2O2 ila 200 mM. Her numune 500 μL H2O2gerektirir.NOT: Söndürme bir gün önce yapılabilir ve ışıktan korundu, 4 °C’de bir gecede saklanabilir. H2O2 deney günü taze yapılmalıdır. 3. Hücreleri topla Bir T175 şişesindeki hücreleri -90 oranında büyütün. Ortamı kaldırın ve arabellekle durulanın.NOT: Kullanılacak tipik tamponlar hücre kültürü sınıfı Dulbecco’nun fosfat tamponlu salini (DPBS) veya Hank’in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) dir. Hücreleri tripsin-EDTA veya kazıyıcı kullanarak ayırın. Bir kez arabellek 10 mL içinde resuspend ayrılmış ve hücreleri saymak. Aşağı dön, arabelleği ve tripsin-EDTA’yı çıkarın ve 2 x 106 hücre/mL yapmak için yeniden askıya alın. Aliquot 500 μL her numune başına hücre.NOT: Her durum için en az 3 lazer örneği ve 3 lazer kontrolü yok. 4. IC-FPOP Yapmak İki 5 mL şırıngayı tamponla, mıknatısları içeren 500 μL şırıngayla ve son 500 μL şırıngayı H2O2 iledoldurun. Manyetik karıştırıcıyı aç. Dikmetil sülfoksit 220 μL (DMSO) söndürme bir aliquot, yavaşça karıştırın ve ışınlanmış örnekleri toplamak için akış sisteminin arkasına yerleştirin. DMSO eklenmesi endojen metiyonin sülfoksit redüktaz inhibe edecek. Lazeri açın, 7’leri bekleyin ve akış sistemini açın. Numune akışı bittikten sonra lazeri kapatın ve toplanan numuneyle söndürmeyi nazikçe karıştırın. 4.5 ve 4.6 adımlarını sırasında bunu kenara yerleştirin. Dört şırıngayı da hücrelerin askıya alınan tamponla doldurun ve akış sisteminden geçirin. Sistem kızarma işlemi bittikten sonra 4.1 ve 4.2 adımlarını tekrarlayın. Işınlama olmadan akışı başlatın. Bu hücrelerde arka plan oksidasyonu için hesap hiçbir lazer kontrolüdür. Bir sonraki numune çalışırken, önceki numuneyi 5 dk için 450-800 x g’de döndürün, çözücüü çıkarın ve radioimmunoçöken analiz (RIPA) tamponu gibi bir hücre lisis tamponunun 100 μL’sinde yeniden askıya alın. Numuneyi bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve sıvı nitrojende flaş dondurma. Tüm numuneler çalışma tamamlandığında, temizleme için akış sistemini sökün. Kullanılan silika boruatın ve % 50 su 1 saat sonicating tarafından diğer tüm bağlantıları temizleyin: 50% metanol. Şırıngaları üreticinin talimatlarına göre temizleyin. 5. Özet Tüm hücre lisatını sindir. Numuneleri eriterek başlayın ve 95 °C’de 10 dakika ısı. Isıtma dan sonra, 15 dakika buz üzerinde lysate soğutun. DNA ve RNA’yı sindirmek için 25 ünite nükleaz ekleyin ve 15 dakika boyunca odada kuluçkaya yatın. 4 °C’de 10 dk için 16.000 x g’de masa üstü santrifüj kullanarak spin örnekleri. Supernatant toplamak ve temiz bir mikrosantrifüj tüp aktarın. Protein elekt kiti kullanarak protein konsantrasyonu kontrol edin. 20-100 μg numuneyi temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 100 μL’ye getirin. 20 mM dithiothreiotol (DTT) ile numuneleri 50 °C’de 45 dakika azaltın. Numuneleri oda sıcaklığında 15 dk soğutun. 20 mM iodoacetamide (IAA) oda sıcaklığında 20 dk ışıktan korunan alkilat. 1:4 oran proteinde önceden soğutulmuş aseton ekleyin: aseton. Örnekleri karıştırın ve -20 °C’ye bir gecede yerleştirin. Ertesi sabah, 4 °C’de 10 dakika boyunca 16.000 x g’de döndürme örnekleri. Supernatant çıkarın ve% 90 önceden soğutulmuş aseton 50 μL ekleyin. Numuneleri karıştırın ve 4 °C’de 5 dk için 16.000 x g’de aşağı doğru döndürün. Asetonu çıkarın ve mikrocentrifuge kapakları üst kapsayan bir tiftik ücretsiz silme ile açık bırakarak örnekleri kurumasını bekleyin. Numuneler kuruduktan sonra 10 mM Tris tampon pH 8 ile protein peletini yeniden askıya alın. 10 mM Tris tampon pH’ın 40 μL’sinde 20 μg tripsin isini yeniden askıya alın. 2 μg tripsin ekleyin (kütle: 1 tripsin kütle oranı: 50 örnek). Bir gecede 37 °C’de kuluçka örnekleri. Ertesi sabah peptit tonu kullanarak peptit konsantrasyonu kontrol edin. Örnek peptit tahliliçin çıkarıldıktan sonra, numunelere formik asit ekleyerek tripsin sindirimini söndürün (son konsantrasyon %5 formik asittir). Son peptit konsantrasyonu belirlendikten sonra, her numuneden 10 μg temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu, her numunenin aynı miktarda analiz edilmesini sağlar. Bir vakum santrifüj kullanarak örnek kuru. 20 μL kütle spektrometresi ile kurutulduktan sonra %0.1 formik asit. Örnekleri otomatik numune şişelerine aktarın. 6. Sıvı Kromatografi-Tandem Kütle Spektrometresi FPOP modifikasyonları lokalize etmek için Sindirilmiş hücre lysate LC-MS/MS analizi kullanarak analiz. Suda %0.1 formik asit (A) ve asetonitrilde (B) %0,1 formik asit mobil fazları kullanın. 180 μm x 20 mm C18 (5 μm ve 100 Å) bindirme sütununa 0,5 μg numune yükleyin ve 15 dakika boyunca (A) ve %1 (B) ile yıkama numunesi alın. 75 μm x 30 cm C18 (5 μm ve 125 Å) analitik kolon kullanarak analitik ayırma yöntemini %3 ‘den başlayan (B) 0,300 μL/dk akış hızıyla çalıştırın ve 1-2 dakikadan itibaren rampa (B) çalıştırın. Sonraki rampa% 45 (B) 2-100 dk sonra% 100 (B) 100-110 dk. 110-115 dk% 100 (B) tutarak sütun temizleyin. 115-116 dk% 3 (B) rampa ve tutmak sütun un% 3 (B) 116-130 min. MS edinme yöntemini m/z teşriyle 375-1500 arasında 60.000 çözünürlüğe sahip olarak ayarlayın. Otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedefini maksimum enjeksiyon süresi 50 ms ile 5,0 x 105 olarak ayarlayın. MS kazanımı sırasında, 1,2 m/z izolasyon penceresi ve 4 s’lik çevrim süresi ile veri bağımlı edinimi (DDA) yoluyla izolasyon için şarj durumları 2-64 olan öncül iyonları seçin. 60 s. 1 MS/MS edinimi sonrası peptidleri hariç takın.4 7. Veri İşleme Raw dosyalarını kullanılabilir bir protein analiz yazılımında ilgili protein veritabanı ve ilgili sindirim enzimine karşı arayın. Burada, Swiss-Prot Homo Sapiens veritabanını ve trypsin’i kullanın. Öncül kütleyi 350 ila 5.000 Da ve 10 ppm’lik bir kütle toleransı arasında arama yapacak şekilde ayarlayın. En fazla 1 6 ila 144 kalıntı arasında bir peptit uzunluğu ile cevapsız dekolte sitesi olabilir. Bu sınırlamalar veritabanı aramakolaylaştırmak. Parça iyonlarının maksimum kütle toleransını karbamidotil (+57.021) ile statik modifikasyon olarak 0.02 Da’ya ve 17 amino asitten dinamik modifikasyon olarak tüm FPOP modifikasyonlarına ayarlayın(Şekil 4, FPOP modifikasyonlarını tespit etmek için kullanılan protein analizi iş akışının bir örneğidir).NOT: Serin ve treonin üzerindeki FPOP modifikasyonları hidroksil radikalleri ile daha düşük reaktivite nedeniyle arama dahil değildir. %1 ve %5’lik yanlış bir keşif oranına sahip bir yem veritabanıyla arama yapın. Dosyalar tamamlandıktan sonra fpop değişikliğinin kapsamını hesaplar. Açık Proteome Discoverer 2.2, ihracat sırası, modifikasyon yerleri, protein katılımı, spektrum dosyası, öncül bolluk ve saklama süresi bilgileri. 4. denklemden modifikasyonun kapsamını hesaplayın:EIC alan modifiye hidroksil radikal modifikasyonu ile belirli bir peptit kromatografik alandır. EIC alanı, o peptidin hem değiştirilmiş hem de değiştirilmemiş alanlarının toplam kromatografik alanıdır. Oksidasyonun kapsamı, ışınlama lı ve radyasyonsuz numunelerde hesaplanır. Örnek atlayan ışınlama (kontrol) h2O2 maruziyetinden önce ve sonra hücrelerde mevcut olabilecek herhangi bir arka plan oksidasyonu için hesaplar. Kontroller, FPOP’a özgü modifikasyonları izole etmeye yardımcı olmak için ışınlama örneklerinden çıkarılır.