Kenmerkend voor cellulaire eiwitten met in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten

1. Ic-FPOP-stroomsysteem opzetten Om te beginnen met de montage van het stroomsysteem, snijd de gesmolten silica met behulp van een decolleté steen op maat. Het IC-FPOP-stroomsysteem vereist vier 12 cm en één 17 cm gesmolten silica met een binnendiameter (ID) van 450 μm en buitendiameter (OD) van 670 μm, twee 24 cm en één 40 cm met een ID van 75 μm en een OD van 360 μm , en tenslotte twee 57 cm met een ID van 150 μm en een OD van 360 μm.OPMERKING: Bij het snijden van de silica buizen, voorzichtig wegschrapen van de polyimide coating, en buigen om de schoonste snede te krijgen. Controleer of het een rechte snede is (dit is nodig om ervoor te zorgen dat er geen blokkades of lekken ontstaan). Stel 15 aansluitingen in met nanostrakke mouwen (0,0155″ ID X 1/16″ OD voor 360 μm OD silicabuizen en 0,027″ ID X 1/16″ OD voor de 670 μm OD silica buizen) met superflangeless moer PEEK 1/4-28 flat-bottom voor 1/16″ OD en super flangeless ferrule w/SST ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 flat-bottom, voor 1/16″ OD. Constructies volgens het protocol van de fabrikant (figuur 1). Plaats 6 kleine cilindrische magneten in één 500 μL spuit. Vul deze spuit samen met nog eens 500 μL spuit en twee 5 mL spuiten met buffer en verwijder lucht. Positie op spuitpomp zoals aangegeven op figuur 2A.OPMERKING: De 5 mL spuiten zijn groter dan de 500 μL spuiten, dus een spacer is nodig om alle spuiten tegelijkertijd op zijn plaats aan te spannen (figuur 2B). Draai de pompstop aan zodat de celspuit ongeveer 50 μL over heeft wanneer de motor vastloopt. Hierdoor blijft er ruimte voor de magnetische roerstaafjes. (Figuur 2C-D).LET OP: Als de spuitpomp druk uitoefent op de magneten, zullen ze de spuit vastlopen en kan de spuit breken. Sluit met behulp van een Luer-adapter een handmatige klep aan op elke spuit. Monteer de silicabuizen zoals afgebeeld in figuur 3.OPMERKING: Rijg de lijn met de cellen + H2O2 helemaal door het kruis naar de andere kant. Plaats het vervolgens in de 450 μm ID silica slang. De omhulselbuffers in de 5 mL spuit zullen sneller stromen dan de cellen en H2O2. Met de omhulselbuffers aan beide zijden worden de cellen hydrodynamisch geconcentreerd in één lijn voor bestraling. Positiestroomsysteem naast laser. Met behulp van een aansteker, burn away de silica coating op de 450 μm ID slang om een venster te maken voor laser bestraling. Plaats een magnetische roeraar boven de celspuit met de zes magneten. Stel de spuitpomp in op 492,4 μL/min voor een eindstroomsnelheid van 1.083,3 μL/min. Stroombuffer drie keer door het systeem om het systeem door te spoelen en te testen op eventuele lekken. Focus de excimer laser op de silica buizen met behulp van een bolle lens. Eenmaal geconcentreerd, test de bestraling venster door het plaatsen van een klein stukje papier achter de silica buizen en zet de laser op. Meet het gebied verbrand door de bestraling. Bereken de benodigde laserfrequentie met behulp van het bestralingsvenster en de stroomsnelheid om een uitsluitingsfractie van nul te verkrijgen.OPMERKING: De aanbevolen laserenergie voor een IC-FPOP-experiment is ≥120 mJ. Om een uitsluitingsfractie van 0 te krijgen met een bestralingsvenster van 2,58 mm en een stroomsnelheid van 1083,3 μL/min, moet de frequentie 44 zijn. Hieronder staan de vergelijkingen die nodig zijn om de laserfrequentie te berekenen als de bestralingsvenster, de biet en de uitsluitingsfractie bekend is.waar w is het volume in nL, x is de laser spot breedte in mm, y is de silica buizen-ID in μm, v is het totale volume in μL, b is de uitsluiting sfractie, een is de stroomsnelheid in μL/min, en f is de frequentie in Hz. 2. Maak blussen en H2O2 Maak blussen met 100 mM N-tert-Butyl-alfa-fenylnitrone (PBN) en 100 mM N,N’-dimethylthiourea (DMTU). Aliquot 11 mL blussen voor elk monster in een 50 mL conische buis. Verdun H2O2 tot 200 mM. Voor elk monster is 500 μL H2O2vereist.LET OP: De quench kan de dag ervoor worden gemaakt en ‘s nachts bij 4 °C worden opgeslagen, beschermd tegen licht. H2O2 moet vers worden gemaakt de dag van experimenteren. 3. Cellen verzamelen Kweek cellen in een T175 kolf tot ongeveer 70-90% samenvloeiing. Verwijder media en spoel af met buffer.OPMERKING: Typische buffers om te gebruiken zijn celkweekkwaliteit Dulbecco’s fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) of Hank’s balanced salt solution (HBSS). Maak cellen los met trypsin-EDTA of met een schraper. Eenmaal losgemaakt opnieuw opschorten in 10 mL buffer en tel de cellen. Draai naar beneden, verwijder de buffer en trypsin-EDTA en bretel opnieuw om 2 x 106 cellen/mL te maken. Aliquot 500 μL van de cellen per monster.LET OP: Maak voor elke voorwaarde minimaal 3 lasermonsters en 3 geen laserbesturing. 4. Ic-FPOP uitvoeren Vul de twee 5 mL spuiten met buffer, de 500 μL spuit met de magneten met de cellen, en de laatste 500 μL spuit met H2O2. Zet de magneetroeraar aan. Piek in 220 μL dimethylsulfoxide (DMSO) tot één aliquot van blussen, meng zachtjes en plaats achter het stroomsysteem om bestraalde monsters te verzamelen. De toevoeging van DMSO remt endogene methioninesulfoxide reductase. Zet laser aan, wacht 7 s en schakel vervolgens het stroomsysteem in. Zodra het monster klaar is met stromen, schakelt u de laser uit en meng tuhet voorzichtig met het verzamelde monster. Plaats dit aan de zijkant tijdens de stappen 4.5 en 4.6. Vul alle vier de spuiten met de buffer waarin de cellen worden opgehangen en door het stroomsysteem stromen. Nadat het systeem is voltooid doorspoelen, herhaalt u de stappen 4.1 en 4.2. Start de stroom zonder bestraling. Dit is de geen lasercontrole om rekening te houden met achtergrondoxidatie in de cellen. Terwijl het volgende monster wordt uitgevoerd, draai het vorige monster op 450-800 x g voor 5 min, verwijder het oplosmiddel en bredig het opnieuw op in 100 μL van een cellysebuffer zoals radioimmunoprecipitation test (RIPA) buffer. Breng het monster over op een microcentrifugebuis en flashvries in vloeibare stikstof. Wanneer alle monsters klaar zijn met draaien, demonteert u het stroomsysteem voor reiniging. Gooi de gebruikte silicabuizen weg en maak alle andere aansluitingen schoon door 1 uur in 50% water te soniceren: 50% methanol. Reinig de spuiten volgens de instructies van de fabrikant. 5. Digest Verteer het hele cellysaat. Begin met ontdooien van de monsters en warmte op 95 °C gedurende 10 min. Na het verwarmen, koel het lysate op ijs voor 15 min. Voeg 25 eenheden nuclease toe om DNA en RNA te verteren en in cubeer in kamer gematigd voor 15 min. Spin monsters met behulp van een tafelblad centrifuge op 16.000 x g voor 10 min bij 4 °C. Verzamel de supernatant en breng het over naar een schone microcentrifugebuis. Controleer de eiwitconcentratie met behulp van een eiwittestkit. Breng 20-100 μg monster over naar een schone microcentrifugebuis en breng naar 100 μL. Verminder monsters met 20 mM dithiothreiotol (DTT) bij 50 °C gedurende 45 min. Koel de monsters op kamertemperatuur gedurende 15 min. Alkylaat met 20 mM iodoacetamide (IAA) bij kamertemperatuur gedurende 20 min beschermd tegen licht. Voeg voorgekoelde aceton toe bij een eiwit van 1:4 verhouding: aceton. Meng monsters en plaats in -20 °C ‘s nachts. De volgende ochtend draaien monsters op 16.000 x g voor 10 min bij 4 °C. Verwijder de supernatant en voeg 50 μL van 90% voorgekoelde aceton toe. Meng monsters en spin naar beneden op 16.000 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Verwijder aceton en laat monsters drogen door de doppen van de microcentrifuge open te laten met een pluisvrij doekje dat de bovenkant bedekt. Nadat de monsters zijn gedroogd, resuspend eiwit pellet met 10 mM Tris buffer pH 8. Resuspend 20 μg trypsine in 40 μL van 10 mM Tris buffer pH 8. Voeg 2 μg trypsine toe (massa: massaverhouding van 1 trypsine: 50 monster). Bebroed monsters bij 37 °C ‘s nachts. De volgende ochtend controleer de peptide concentratie met behulp van een peptide test. Nadat het monster is verwijderd voor de peptide test, doven de trypsine spijsvertering door toevoeging van mierenzuur aan de monsters (uiteindelijke concentratie is 5% mierenzuur). Zodra de uiteindelijke peptideconcentratie is bepaald, breng je 10 μg van elk monster over naar een schone microcentrifugebuis. Dit zorgt ervoor dat dezelfde hoeveelheid van elk monster wordt geanalyseerd. Droog het monster met behulp van een vacuümcentrifuge. Eenmaal gedroogd opnieuw opschorten met 20 μL massaspectrometriegraad van 0,1% formisch zuur. Breng monsters over naar autosamplerflesjes. 6. Vloeibare chromatografie-tandemmassaspectrometrie Om FPOP-wijzigingen te lokaliseren, analyseren we het verteerde cellysaat met behulp van LC-MS/MS-analyse. Gebruik mobiele fasen van 0,1% mierenzuur in water (A) en 0,1% mierenzuur in acetonitril (B). Laad 0,5 μg monster op een overvulkolom van 180 μm x 20 mm C18 (5 μm en 100 Å) en wasmonster met 99% (A) en 1% (B) gedurende 15 min. Voer met behulp van een analytische scheidingskolom van 75 μm x 30 cm C18 (5 μm en 125 Å) de analytische scheidingsmethode uit met een stroomsnelheid van 0,300 μL/min vanaf 3% (B) gedurende één min en vervolgens naar 10% (B) van 1-2 min. Volgende oprit naar 45% (B) van 2-100 min dan 100% (B) van 100-110 min. Maak de kolom schoon door 100% (B) vast te houden van 110-115 min. Recondition de kolom door naar beneden te gaan tot 3% (B) van 115-116 min en houd op 3% (B) van 116-130 min. Stel de MS-acquisitiemethode in op een resolutie van 60.000 met een m/z-scanbereik van 375-1500. Stel de doelstelling automatische gain control (AGC) in op 5,0 x 105 met een maximale inspuittijd van 50 ms. Selecteer tijdens de MS-overname de voorloperionen met een charge 2-6 voor isolatie via dataafhankelijke acquisitie (DDA) met een isolatievenster van 1,2 m/z en een cyclustijd van 4 s. Selecteer de peptiden met een intensiteitsdrempel van 5,0 x 104 voor HCD-activering met een genormaliseerde energie ingesteld op 32%. Sluit de peptiden uit na 1 MS/MS-overname voor 60 s. Stel de MS/MS-resolutie in op 15.000 met een AGC-doelstelling van 5,0 x 104 en een maximale injectietijd van 35 ms. 7. Gegevensverwerking Doorzoek de RAW-bestanden op een beschikbare eiwitanalysesoftware tegen een relevante eiwitdatabase en het relevante digestenzym. Hier, gebruik maken van de Zwitsers-Prot Homo Sapiens database en trypsine. Stel de voorlopermassa in om tussen 350 en 5.000 Da en een massatolerantie van 10 ppm te zoeken. Er kan hoogstens 1 gemiste decolletéplaats zijn met een peptidelengte tussen 6 tot 144 residuen. Deze beperkingen vergemakkelijken het zoeken in de database. Stel de fragmentionen maximale massatolerantie in op 0,02 Da met de carbamidomethyl (+57.021) als statische modificatie en alle FPOP-modificaties van 17 aminozuren als dynamische wijziging(figuur 4 is een voorbeeld van de eiwitanalyseworkflow die wordt gebruikt om FPOP-wijzigingen te detecteren).OPMERKING: FPOP-wijzigingen op serine en threonine zijn niet opgenomen in het zoeken vanwege hun lagere reactiviteit met hydroxylradicalen. Zoek met een lokdatabase met een vals ontdekkingspercentage van 1% en 5%. Zodra bestanden klaar zijn met zoeken bereken de omvang van FPOP wijziging. Open Proteome Discoverer 2.2, export sequentie, modificatie locaties, eiwit toetreding, spectrum bestand, voorloper overvloed, en retentie tijd informatie. Bereken de omvang van de wijziging uit vergelijking 4:Het eic-gebied dat wordt gewijzigd is het chromatografisch gebied van een specifiek peptide met een hydroxylradicale modificatie. Het EIC-gebied is het totale chromatografische gebied van zowel gemodificeerde als ongewijzigde gebieden van dat specifieke peptide. De mate van oxidatie wordt berekend in de monsters met en zonder bestraling. Het monster dat bestraling (controle) weglaat, is verantwoordelijk voor eventuele achtergrondoxidatie die vóór en na blootstelling van H2O2 in de cellen aanwezig had kunnen zijn geweest. De besturingselementen worden afgetrokken van de bestralingsmonsters om FPOP-specifieke wijzigingen te isoleren.