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Genética

Caracterización de la diferenciación in vitro de los queratinocitos primarios humanos por análisis de ARN-Seq

Published: May 16, 2020
doi:
10.3791/60905
, , ,
1Department of Molecular Developmental Biology, Faculty of Science, Radboud Institute for Molecular Life Sciences,Radboud University, Nijmegen, The Netherlands, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Center,Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Nijmegen, The Netherlands, 3Department of Human Genetics,Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands

Summary

Aquí se presenta un procedimiento escalonado para la diferenciación in vitro de queratinocitos primarios humanos por inhibición del contacto seguido de caracterización a nivel molecular por el análisis de ARN-seq.

Abstract

Los queratinocitos primarios humanos se utilizan a menudo como modelos in vitro para estudios sobre la diferenciación epidérmica y enfermedades relacionadas. Se han notificado métodos para la diferenciación in vitro de queratinocitos cultivados en formas sumergidas bidimensionales (2D) utilizando diversas condiciones de inducción. Aquí se describe un procedimiento para el método de diferenciación de queratinocitos in vitro 2D por inhibición del contacto y posterior caracterización molecular por ARN-seq. En resumen, los queratinocitos se cultivan en medio de queratinocitos definidos complementados con factores de crecimiento hasta que son totalmente confluentes. La diferenciación es inducida por contactos estrechos entre los queratinocitos y se estimula aún más excluyendo los factores de crecimiento en el medio. Utilizando análisis de ARN-seq, se muestra que ambos 1) queratinocitos diferenciados exhiben firmas moleculares distintas durante la diferenciación y 2) el patrón de expresión génica dinámica se asemeja en gran medida a las células durante la estratificación epidérmica. En cuanto a la comparación con la diferenciación normal de queratinocitos, los queratinocitos portadores de mutaciones del factor de transcripción p63 exhiben morfología alterada y firmas moleculares, consistentes con sus defectos de diferenciación. En conclusión, este protocolo detalla los pasos para la diferenciación de queratinocitos in vitro 2D y su caracterización molecular, con énfasis en el análisis bioinformático de los datos de ARN-seq. Debido a que la extracción de ARN y los procedimientos de ARN-seq han sido bien documentados, no es el foco de este protocolo. El procedimiento experimental de diferenciación in vitro de queratinocitos y tubería de análisis bioinformático se puede utilizar para estudiar eventos moleculares durante la diferenciación epidérmica en queratinocitos sanos y enfermos.

Introduction

Los queratinocitos primarios humanos derivados de la piel humana se utilizan a menudo como modelo celular para estudiar la biología de la epidermis1,2,3,4. La estratificación de la epidermis se puede modelar por diferenciación de queratinocitos, ya sea en una moda monocapa sumergida 2D o 3D aire-lift modelo organotípico2,3,5,6,7. Aunque los modelos 3D se han vuelto cada vez más importantes para evaluar la estructura epidérmica y la función, los modelos de diferenciación 2D siguen siendo ampliamente utilizados, debido a su comodidad y la posibilidad de generar un gran número de células para análisis.

Se han aplicado varias condiciones para inducir la diferenciación de queratinocitos en 2D, incluyendo la adición de suero, alta concentración de calcio, menor temperatura e inhibición de los receptores del factor de crecimiento epidérmico2,3. Cada uno de estos métodos ha sido validado por una serie de genes marcadores de diferenciación de queratinocitos y ha demostrado ser eficaz en la evaluación de la diferenciación de queratinocitos, incluso en condiciones patológicas. Sin embargo, estas condiciones de inducción también muestran diferencias en su eficiencia de diferenciación y cinética cuando se examinan paneles específicos de genes marcadores2,3.

Uno de estos métodos implica la inhibición del contacto con queratinocitos y el agotamiento de los factores de crecimiento en el medio de cultivo8. Se ha demostrado que los queratinocitos pueden diferenciarse espontáneamente cuando las células alcanzan la densidad completa.  Excluir los factores de crecimiento en el medio de cultivo puede mejorar aún más la diferenciación. Se ha demostrado que el método que combina la inhibición del contacto y agota los factores de crecimiento genera que los queratinocitos diferenciados con patrones de expresión génica similares a la epidermis estratificada normal cuando se utilizan varios marcadores epidérmicos3,lo que sugiere que este modelo es adecuado para estudiar la diferenciación normal de queratinocitos. Recientemente, se han notificado dos análisis completos de expresión génica de la diferenciación de queratinocitos utilizando este modelo9,10. Los investigadores validaron este modelo a nivel molecular y demostraron que se puede utilizar para estudiar la diferenciación normal y enferma de queratinocitos.

Este protocolo describe el procedimiento para el método de diferenciación in vitro y el análisis molecular de células diferenciadas utilizando ARN-seq. También ilustra la caracterización del transcriptoma de las células en el día de diferenciación 0 (etapa de proliferación), el día 2, el día 4 y el día 7 (diferenciación temprana, media y tardía, respectivamente). Se muestra que los queratinocitos diferenciados muestran patrones de expresión génica que se asemejan en gran medida a las células durante la estratificación epidérmica. Para examinar si este método se puede utilizar para el estudio de la patología cutánea, aplicamos la misma canalización experimental y de análisis para investigar queratinocitos portadores de mutaciones del factor de transcripción p63 que se derivan de pacientes con ectrodactyly, displasia ectodérmica y síndrome de labio/paladar hendido (CEE)11,12. Este protocolo se centra en la diferenciación in vitro de los queratinocitos, así como en el posterior análisis bioinformático del ARN-seq. Otros pasos en el procedimiento completo como la extracción de ARN, la preparación de muestras de ARN-seq y la construcción de bibliotecas, están bien documentados y se pueden seguir fácilmente, especialmente cuando se utilizan muchos kits comerciales de uso común. Por lo tanto, estos pasos se describen brevemente en el protocolo. Los datos muestran que esta tubería es adecuada para el estudio de eventos moleculares durante la diferenciación epidérmica en queratinocitos sanos y enfermos.

Protocol

Las biopsias cutáneas se tomaron del tronco de voluntarios sanos o pacientes con mutaciones p63, para establecer el cultivo primario de queratinocitos. Todos los procedimientos relativos al establecimiento de queratinocitos primarios humanos fueron aprobados por el comité ético del Centro Médico Nijmegen de la Universidad Radboud (“Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen”). Se obtuvo el consentimiento informado. 1. Diferenciación de queratinocitos primarios humanos por inhibición …

Representative Results

Diferenciación normal de queratinocitos y análisis de ARN-seqEn este experimento, se utilizaron líneas de queratinocitos derivadas de cinco individuos para la diferenciación y análisis de ARN-seq. La Figura 1 resume el procedimiento experimental de diferenciación y los resultados del análisis de ARN-seq. En la Figura 1Ase ilustra una visión general de los procedimientos de diferenciación in vitro de los queratinocitos normales y los…

Discussion

Este trabajo describe un método para inducir la diferenciación de queratinocitos humanos y la posterior caracterización utilizando análisis de ARN-seq. En la literatura actual, muchos estudios sobre la diferenciación de queratinocitos humanos utilizan otros dos métodos, con una alta concentración de calcio o con suero como métodos para inducir la diferenciación2,3,23. Un informe anterior comparó cuidadosamente estos tr…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación fue apoyada por la Organización Neerlandesa para la Investigación Científica (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Beca de la Universidad Radboud (H.Z.); y la subvención del Consejo De Becas China 201406330059 (J.Q.).

Materials

Bioanalyzer 2100 Agilent G2929BA
Bovine pituitary extract (BPE) Lonza Part of the bulletKit
CFX96 Real-Time system Bio-Rad qPCR machine
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8537
Epidermal Growth Factor (EGF) Lonza Part of the bulletKit
Ethanolamine >= 98% Sigma-Aldrich E9508
High Sensitivity DNA chips Agilent 5067-4626
Hydrocortison Lonza Part of the bulletKit
Insulin Lonza Part of the bulletKit
iQ SYBR Green Kit BioRad 170-8886
iScript cDNA synthesis Bio rad 1708890
KAPA Library Quant Kit Roche 07960255001 Low concentration measure kit
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase Roche KK8540 RNAseq kit
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Lonza 192060
Nanodrop deNovix DS-11 FX (model) Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements
NEXTflex DNA barcodes -24 Illumnia NOVA-514103 6 bp long primers
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
RNA Pico Chip Agilent 5067-1513
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Referências

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In VitroKeratinocyte DifferentiationRNA-seq2D MonolayerProliferation MediumDifferentiation MediumCell Seeding DensityRNA IsolationCDNA ConversionLibrary PreparationNext-generation SequencingRead MappingDESeq2RLD NormalizationVST Normalization

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Citar este artigo
Smits, J. G., Qu, J., Niehues, H., Zhou, H. Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis. J. Vis. Exp. (159), e60905, doi:10.3791/60905 (2020).
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