Caractérisation de la différenciation in vitro des kératinocytes primaires humains par analyse ARN-Seq
Summary
Présenté ici est une procédure stepwise pour la différenciation in vitro des kératinocytes primaires humains par inhibition de contact suivie de la caractérisation au niveau moléculaire par l’analyse d’ARN-seq.
Abstract
Les kératinocytes primaires humains sont souvent utilisés comme modèles in vitro pour des études sur la différenciation épidermique et les maladies connexes. Des méthodes ont été rapportées pour la différenciation in vitro des kératinocytes cultivés dans les manières submergées bidimensionnelles (2D) utilisant diverses conditions d’induction. Décrit ici est une procédure pour la méthode de différenciation in vitro de kératinocyte 2D par inhibition de contact et caractérisation moléculaire suivante par ARN-seq. En bref, les kératinocytes sont cultivés dans le milieu défini de kératinocyte complété avec des facteurs de croissance jusqu’à ce qu’ils soient entièrement confluents. La différenciation est induite par des contacts étroits entre les kératinocytes et encore stimulée par l’exclusion des facteurs de croissance dans le milieu. À l’aide d’analyses ARN-seq, il est démontré que les deux 1) kératinocytes différenciés présentent des signatures moléculaires distinctes lors de la différenciation et 2) le modèle dynamique d’expression des gènes ressemble en grande partie aux cellules pendant la stratification épidermique. En ce qui concerne la comparaison à la différenciation normale des kératinocytes, les kératinocytes porteurs de mutations du facteur de transcription p63 présentent une morphologie altérée et des signatures moléculaires, compatibles avec leurs défauts de différenciation. En conclusion, ce protocole détaille les étapes de la différenciation in vitro des kératinocytes 2D et de sa caractérisation moléculaire, en mettant l’accent sur l’analyse bioinformatique des données arn-seq. Étant donné que l’extraction de l’ARN et les procédures ARN-seq ont été bien documentées, ce n’est pas l’objet de ce protocole. La procédure expérimentale de différenciation in vitro des kératinocytes et du pipeline d’analyse bioinformatique peut être utilisée pour étudier les événements moléculaires lors de la différenciation épidermique chez les kératinocytes sains et maladies.
Introduction
Les kératinocytes primaires humains dérivés de la peau humaine sont souvent utilisés comme modèle cellulaire pour étudier la biologie de l’épiderme1,2,3,4. La stratification de l’épiderme peut être modélisée par différenciation des kératinocytes, soit d’une manière monocouche immergée en 2D, soit par le modèle organotypique 3D de levage d’air2,3,5,6,7. Bien que les modèles 3D soient devenus de plus en plus importants pour évaluer la structure et la fonction épidermiques, les modèles de différenciation 2D sont encore largement utilisés, en raison de leur commodité et de la possibilité de générer un grand nombre de cellules pour les analyses.
Diverses conditions ont été appliquées pour induire la différenciation des kératinocytes en 2D, y compris l’ajout de sérum, une forte concentration de calcium, une température plus basse et l’inhibition des récepteurs du facteur de croissance épidermique2,3. Chacune de ces méthodes a été validée par un certain nombre de gènes marqueurs de différenciation des kératinocytes et s’est montrée efficace dans l’évaluation de la différenciation des kératinocytes, y compris dans des conditions pathologiques. Cependant, ces conditions d’induction montrent également des différences dans leur efficacité de différenciation et cinétique lorsque des panneaux spécifiques de gènes marqueurssont examinés 2,3.
Une de ces méthodes implique l’inhibition de contact de kératinocyte et l’épuisement des facteurs de croissance dans le milieu de culture8. Il a été démontré que les kératinocytes peuvent se différencier spontanément lorsque les cellules atteignent leur pleine densité. L’exclusion des facteurs de croissance dans le milieu culturel peut encore améliorer la différenciation. La méthode combinant l’inhibition de contact et les facteurs de croissance appauvrissants a été montrée pour générer des kératinocytes différenciés avec des modèles d’expression de gène semblables à l’épiderme stratifié normal en utilisant plusieurs marqueurs épidermiques3,suggérant que ce modèle est approprié pour étudier la différenciation normale de kératinocyte. Récemment, deux analyses complètes d’expression génétique de la différenciation des kératinocytes à l’aide dece modèle ont été rapportées 9,10. Les chercheurs ont validé ce modèle au niveau moléculaire et ont montré qu’il peut être utilisé pour étudier la différenciation normale et maladie des kératinocytes.
Ce protocole décrit la procédure pour la méthode de différenciation in vitro et l’analyse moléculaire des cellules différenciées utilisant l’ARN-seq. Il illustre également la caractérisation du transcriptome des cellules le jour de différenciation 0 (stade de prolifération), le jour 2, le jour 4 et le jour 7 (différenciation précoce, moyenne et tardive, respectivement). Il est démontré que les kératinocytes différenciés affichent des modèles d’expression génétique qui ressemblent en grande partie à des cellules pendant la stratification épidermique. Pour examiner si cette méthode peut être employée pour étudier la pathologie de peau, nous avons appliqué le même pipeline expérimental et d’analyse pour étudier des keratinocytes portant des mutations du facteur de transcription p63 qui sont dérivés des patients présentant ectrodactyly, displasie ectodermale et cleft lip/palate (EEC) syndrome11,12. Ce protocole se concentre sur la différenciation in vitro des kératinocytes ainsi que sur l’analyse bioinformatique subséquente de l’ARN-seq. D’autres étapes de la procédure complète, telles que l’extraction de l’ARN, la préparation de l’échantillon d’ARN-seq et la construction de bibliothèques, sont bien documentées et peuvent être facilement suivies, en particulier lors de l’utilisation de nombreux kits commerciaux couramment utilisés. Par conséquent, ces étapes ne sont décrites que brièvement dans le protocole. Les données montrent que ce pipeline est approprié pour étudier les événements moléculaires pendant la différenciation épidermique chez les kératinocytes sains et maladies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce travail décrit une méthode pour induire la différenciation humaine de kératinocyte et la caractérisation suivante utilisant des analyses d’ARN-seq. Dans la littérature actuelle, beaucoup d’études sur la différenciation humaine de kératinocyte emploient deux autres méthodes, avec une concentration élevée de calcium ou avec le sérum comme méthodes pour induire la différenciation2,3,23. Un rapport précédent …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Bourse de l’Université Radboud (H.Z.); et subvention du Conseil chinois des bourses d’études 201406330059 (J.Q.).
Materials
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2929BA | |
| Bovine pituitary extract (BPE) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| CFX96 Real-Time system | Bio-Rad | qPCR machine | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Ethanolamine >= 98% | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| High Sensitivity DNA chips | Agilent | 5067-4626 | |
| Hydrocortison | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Insulin | Lonza | Part of the bulletKit | |
| iQ SYBR Green Kit | BioRad | 170-8886 | |
| iScript cDNA synthesis | Bio rad | 1708890 | |
| KAPA Library Quant Kit | Roche | 07960255001 | Low concentration measure kit |
| KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase | Roche | KK8540 | RNAseq kit |
| KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Nanodrop | deNovix | DS-11 FX (model) | Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements |
| NEXTflex DNA barcodes -24 | Illumnia | NOVA-514103 | 6 bp long primers |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 |
Referências
- Hardman, J. A. Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease. British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).
- Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control. PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).
- Van Ruissen, F., et al. Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures. Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).
- Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
- Ali, N., et al. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
- Luis, N. M., et al. Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4. Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).
- Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).
- Poumay, Y., Pittelkow, M. R. Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins. Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).
- Kouwenhoven, E. N., et al. Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation. EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).
- Qu, J., et al. Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape. Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).
- Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. The p63 gene in EEC and other syndromes. Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).
- Browne, G., et al. Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias. Journal of Cell Science. 124, 2200-2207 (2011).
- . KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Available from: https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit (2019)
- Doyle, K. a. M. . Protocols and applications guide. , (1996).
- . Hyperprep Kit Available from: https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html (2019)
- . TrimGalore Available from: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore (2019)
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- . Convert chromosome names in a bigWig file Available from: https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721 (2019)
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
- Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
- Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).
- Mullegama, S. V., et al. Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
- Ma, F., et al. A comparison between whole transcript and 3′ RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods. BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).
- Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
- Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
- Oyola, S. O., et al. Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes. BMC Genomics. 13, 1 (2012).
- Quail, M. A., et al. Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries. Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
- Ross, M. G., et al. Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).
- . ARMOR Available from: https://github.com/csoneson/ARMOR (2019)
- . snakemake-workflows Available from: https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows (2019)
