Metallbegrenztes Wachstum von Neisseria gonorrhoeae für die Charakterisierung von metallresponsiven Genen und Metallakquise von Host Ligands

Neisseria gonorrhoeae verursacht die häufige sexuell übertragbare Infektion Gonorrhoe. Während der Infektion, pathogene Neisseria drücken ein Repertoire von metallreagierenden Genen, die die Bakterien ermöglichen, Metallrestriktionsbemühungen durch den menschlichen Wirt zu überwinden^1,2,3. Spurenmetalle wie Eisen und Zink spielen eine Schlüsselrolle in vielen zellulären Prozessen, wie die Bindung an Enzyme an katalytischen Stellen, die Teilnahme an Redoxreaktionen und als strukturelle Faktoren in verschiedenen Proteinen^4,5. Unter metallbegrenzten Bedingungen werden metallresponsive Loci ausgepresst und ihre resultierenden Proteine können den Erwerb dieser Nährstoffe unterstützen. Die Charakterisierung dieser Gene und Proteine stellt eine einzigartige technische Herausforderung für den Forscher dar. Metallionen müssen Bakterien vorenthalten werden, um die Transkription dieser Gene aus ihren nativen Loci zu induzieren, aber eine effektive Chelation dieser Ionen aus metallbeladenen Medien kann schwierig zu optimieren sein. Die verschiedenen Metallprofile von Quellwasser und inhärenten Los-zu-Los-Variation⁶ von pulverförmigen Zutaten bedeutet, dass die Menge an Chelat erforderlich, um ein bestimmtes Metall aus einem reichen Medium zu entfernen variiert zwischen verschiedenen Standorten, Zutaten Anbieter, und sogar im Laufe der Zeit innerhalb eines einzigen Labors als chemische Inventar ersetzt wird.

Um diese Herausforderung zu umgehen, beschreiben wir die Herstellung eines definierten Mediums, das während der Vorbereitung mit Chelex-100-Harz behandelt wird, um Spurenmetalle aus der Lösung zu entfernen. Dieses Medium ist ausreichend nährstoffreich, um das Wachstum von Gonokokken zu ermöglichen, die außerhalb des menschlichen Wirts schwer zu kultitochern ist, und ermöglicht es dem Prüfer, ein bestimmtes Metallprofil durch Addition eigener definierter Quellen und Konzentrationen von Metalle. Die Methode des kontrollierten Add-back von gewünschten Metallen zu erschöpftem Medium erhöht die experimentelle Konsistenz und ermöglicht robuste, reproduzierbare Experimente unabhängig von Faktoren wie Wasserquelle und chemischen Chargenzahlen. Darüber hinaus kann dieses Medium entweder als Flüssigkeit oder Feststoff mit nur geringfügigen Modifikationen eingesetzt werden, was es sehr vielseitig macht.

Um den Nutzen dieses Mediums zu demonstrieren, skizzieren wir ein Protokoll für seine Verwendung für gonokokken Wachstum und beschreiben drei erfolgreiche Experimente zur Charakterisierung metallempfindlicher Neisseria-Gene. Zunächst bereiten wir Gonokokken-Vollzelllysate aus metallenen oder ergänzten Kulturen vor und zeigen eine variable Proteinproduktion aus metallresponsiven Loci. Wir skizzieren dann einen zinkbeschränkten Wachstumstest, bei dem das Gonokokkenwachstum durch Supplementierung spezifischer, verwendbarer Zinkquellen gesteuert wird. Schließlich zeigen wir verbindliche Assays, die ganze Gonokokkenzellen zeigen, die metallresponsive Oberflächenrezeptoren exdrücken, die an ihre jeweiligen metallhaltigen Liganden binden. Eine erfolgreiche Oberflächendarstellung dieser Rezeptoren erfordert Wachstum in metallenen, erschöpften Medien.

Das vorliegende Protokoll wurde speziell für Neisseria gonorrhoeaeoptimiert, aber zahlreiche andere bakterielle Krankheitserreger verwenden Metallerfassungsstrategien während der Infektion⁷, so dass dieses Protokoll für die Untersuchung der Metallhomöostase bei anderen Bakterien angepasst werden kann. Die Optimierung dieser Medien und dieser experimentellen Protokolle für den Einsatz in anderen Bakterien erfordert wahrscheinlich eine leichte Änderung der Metallchelatorkonzentrationen und/oder Behandlungszeit mit Chelex-100, da andere Bakterien leicht andere Metallanforderungen als Gonococcus haben können. Eisen und Zink sind die Hauptmetalle, die für die beschriebenen Untersuchungen von Belang sind, aber andere Metalle (z. B. Mangan) wurden als kritisch für Bakterien nachgewiesen, einschließlich Neisseria^8,9,10,11,12. Darüber hinaus wurden ähnliche Methoden für Metallcharakterisierungen in der eukaryotischen Zellkulturarbeit beschrieben, die ebenfalls in Betracht gezogen werden können. ¹³