Hier presenteren we twee gemakkelijk te volgen stapsgewijze protocollen voor plaatsvoorkeursparadigma’s met behulp van optogenetica bij muizen. Met behulp van deze twee verschillende opstellingen, voorkeur en vermijding gedrag kan stevig worden beoordeeld binnen hetzelfde apparaat met een hoge ruimtelijke en temporele selectiviteit, en op een eenvoudige manier.
Begrijpen hoe neuronale activering leidt tot specifieke gedragsoutput is fundamenteel voor de moderne neurowetenschappen. Door optogenetica bij knaagdieren te combineren met gedragstests in gevalideerde paradigma’s, kan de meting van gedragsgevolgen bij stimulatie van verschillende neuronen in real-time met een hoge ruimtelijke en temporele selectiviteit, en dus de oprichting van causale relaties tussen neuronale activering en gedrag. Hier beschrijven we een stap-voor-stap protocol voor een real-time plaats voorkeur (RT-PP) paradigma, een aangepaste versie van de klassieke geconditioneerde plaats voorkeur (CPP) test. De RT-PP wordt uitgevoerd in een apparaat met drie compartimenten en kan worden gebruikt om te beantwoorden als optogenetische stimulatie van een specifieke neuronale populatie lonend of aversief is. We beschrijven ook een alternatieve versie van het RT-PP protocol, het zogenaamde neutral compartment preference (NCP) protocol, dat kan worden gebruikt om aversie te bevestigen. De twee benaderingen zijn gebaseerd op uitbreidingen van de klassieke methodologie afkomstig van gedragsfarmacologie en de recente implementatie van optogenetica binnen de neurowetenschappen. Naast het meten van plaatsvoorkeur in real time, kunnen deze opstellingen ook informatie geven over geconditioneerd gedrag. We bieden eenvoudig te volgen stapsgewijze protocollen naast voorbeelden van onze eigen gegevens en bespreken belangrijke aspecten waarmee we rekening moeten houden bij het toepassen van dit soort experimenten.
De implementatie van optogenetica, een modern neurowetenschappelijk experimenteel instrument waarbij licht wordt gebruikt om neuronale activiteit te controleren, heeft in de afgelopen jaren geleid tot grote vooruitgang in het begrijpen hoe specifieke neuronale populaties gedragbeïnvloeden 1,2,3. De uitstekende ruimtelijke en temporele selectiviteit van de optogenetica maakt het mogelijk om causale verbanden te leggen tussen excitatie of remming van celgroepen van belang en gedragsoutput2,3. Ruimtelijke selectiviteit in de optogenetica wordt vaak gewaarborgd door het Cre-Lox-systeem waarbij de activiteit van Cre recombinase leidt tot een recombinatie van alle DNA-sequenties die aanwezig zijn tussen Lox-sites, de zogenaamde floxed allelen (geflankeerd door lox-sites)4. Het doel met het gebruik van de Cre-Lox systeem in optogenetica is het bereiken van expressie van alleles codering optogenetische opsinen in specifieke neuronen van belang, terwijl het verlaten van de omliggende neuronen verstoken van expressie. Opsins zijn lichtgevoelige eiwitten die bij lichtstimulatie van specifieke golflengte ionenstroom toestaan die neurale prikkelbaarheid beïnvloedt of cellulaire functies beïnvloedt door downstream-effectortrajecten te moduleren. Nieuwe varianten van opsins die verschillen in actie (excitatory, remmend, modulatorisch), mechanisme, activering door licht golflengte en kinetiek eigenschappen5 worden voortdurend ontwikkeld om te voldoen aan de behoeften van specifieke experimentele benaderingen. Met betrekking tot prikkelbaarheid, met behulp van een depolariserende of hyperpolariserende opsin dicteert de activiteit van de neuronen (opwinding of remming, respectievelijk) op lichtstimulatie op een specifieke golflengte geleverd in de hersenen3.
Selectieve promotor activiteit stuurt de uitdrukking van Cre recombinase naar de neuronen van belang. Door de uitvoering van een floxed allel van de opsin van belang, Cre-gemedieerde recombinatie zal ervoor zorgen dat de opsin selectief wordt uitgedrukt in neuronen die co-express Cre recombinase3,6. Dit gebruik van dubbele transgenics om ruimtelijke selectiviteit te sturen is zeer efficiënt gebleken in de optogenetica. Dus, terwijl lichtstimulatie om de opsins te activeren in grote lijnen wordt geleverd via een intracerebrale geïmplanteerde optische vezel aangesloten op een lichtbron (LED of laser)3, alleen neuronen uitdrukken zowel Cre recombinase en de floxed opsin allel zal reageren op deze stimulatie. Het Cre-Lox-systeem bij knaagdieren kan op verschillende manieren worden bereikt door alleen transgenics te gebruiken (zowel Cre recombinase als de floxed opsinconstructie worden gecodeerd bij transgene dieren), alleen virale injecties (DNA-constructies voor Cre recombinase en de floxed opsin worden beide geleverd via een virale drager), of een combinatie van de twee (bijvoorbeeld, Cre recombinase wordt gecodeerd door een transgeen dier dat wordt geïnjecteerd met een virus dat de floxed opsinconstructie draagt)5. De floxed opsin DNA constructie wordt meestal gekloond in frame met een reporter gen om visualisatie van Cre-gemedieerde recombinatie in weefselsecties mogelijk te maken. Terwijl optogenetica kan ook worden uitgevoerd bij ratten, de gepresenteerde protocollen zijn gegenereerd voor muizen. Voor de eenvoud zullen muizen die zowel Cre recombinase als de floxed opsin dragen, “optogeneticamuizen” worden genoemd. In de onderstaande protocollen zijn optogeneticamuizen gegenereerd door een gemengde transgene (Cre recombinase onder controle van twee verschillende promotors) en viraal (met behulp van een adeno-geassocieerd virus, AAV, om de floxed opsin DNA-constructie te leveren – in ons geval ChR2/H134R) aanpak. Het verkrijgen en onderhouden van transgene muislijnen is een essentieel onderdeel van de methodologie. Cre-driver en floxed opsin transgene muizen kunnen worden geproduceerd voor elk doel, of gekocht indien commercieel beschikbaar, net als een reeks van virussen die DNA-sequenties codering Cre recombinase en floxed opsins in verschillende vormen.
Optogenetica in combinatie met gedragstests heeft bewezen een waardevol hulpmiddel te zijn om de rol van verschillende hersengebieden, of discrete neuronale populaties, in bepaalde soorten gedrag te bestuderen. In de context van beloningsgerelateerd gedrag heeft optogenetica de verificatie van eerdere bevindingen op het gebied van gedragsfarmacologie en experimentele psychologie mogelijk gemaakt, en ook een nieuw niveau van spatio-tijdelijk relevante dissectie mogelijk gemaakt in hoe bepaalde neuronen gedrag beïnvloeden. Een methode die is gebruikt in verschillende studies om beloning-gerelateerd gedrag te beoordelen is een aangepaste versie van de klassieke methode bekend als Conditioned Place Preference (CPP). Klassieke CPP is gebruikt om de lonende of aversieve eigenschappen van drugs van misbruik te beoordelen door hun vermogen om Pavlovassociaties te induceren met signalen van het milieu7,8. In Pavlovtermen is het medicijn een ongeconditioneerde stimulus, omdat het een aanpak of terugtrekking kan uitlokken als het respectievelijk lonend of aversief is. Continue koppeling van het medicijn met verschillende neutrale stimuli, die zelf geen reactie uitlokken, kan leiden tot aanpak of terugtrekking alleen bij presentatie van het voorheen neutrale, maar na het koppelen, zogenaamde geconditioneerde stimuli9. CPP-analyse wordt meestal uitgevoerd in een apparaat met twee compartimenten van dezelfde grootte, maar waar elk compartiment wordt gedefinieerd door verschillende kenmerken, zoals vloertextuur, wandpatronen en verlichting (neutrale stimuli). De twee compartimenten zijn met elkaar verbonden door een gang of een opening tussen de compartimenten. Tijdens conditionering, het onderwerp, meestal een klein knaagdier, ontvangt passieve injecties van een geneesmiddel, terwijl beperkt tot een van de twee belangrijkste compartimenten en zout, terwijl beperkt tot het andere compartiment. De lonende effecten van het medicijn worden vervolgens beoordeeld in een drugsvrije sessie wanneer het onderwerp het hele apparaat vrij mag verkennen. De hoeveelheid tijd doorgebracht in de eerder drug-paired compartiment (de geconditioneerde reactie) wordt beschouwd als Pavlovian leermechanismen gemediet tussen de lonende effecten van het geneesmiddel en de signalen van het compartiment in verband met de toediening(geconditioneerde stimuli) weerspiegelen. Als het dier meer tijd doorbrengt in het gedrug-gekoppelde compartiment, heeft het medicijn een geconditioneerde plaatsvoorkeur geïnduceerd, wat betekent dat het lonende effecten op gedrag heeft. Aan de andere kant, als het medicijn als aversie wordt ervaren, zal het dier het met drugs gepaarde compartiment vermijden en meer tijd doorbrengen in het zoutgekoppelde compartiment, wat aangeeft op geconditioneerde plaatsaversie (CPA)8,9,10,11.
Aangezien optogenetica kan worden geïmplementeerd om neuronale activiteit in “real-time” te controleren, het gebruik van een gedragsparadigma vergelijkbaar met, maar onderscheiden van, de CPP setup zorgt voor het meten van plaats voorkeur op directe neuronale activering. Optogenetica-gedreven analyse van plaatsvoorkeur wordt daarom vaak aangeduid als een real-time plaatsvoorkeur (RT-PP) analyse paradigma. In het RT-PP paradigma vervangt optogenetische stimulatie van verschillende neuronen via het Cre-Lox-systeem de systemische levering van een geneesmiddel uitgevoerd in het klassieke CPP, zodat het RT-PP-paradigma in plaats daarvan meet of optogenetisch geïnduceerde neuronale stimulatie gezien als lonend of aversief. De huidige beschrijving zal zich richten op optogenetica muizen, maar ook optogenetica ratten kunnen worden getest met behulp van soortgelijke protocollen.
In plaats van conditionering naar een compartiment op een moment als in de klassieke CPP paradigma, de optogenetica muis in de RT-PP paradigma is toegestaan om vrij te bewegen in het hele apparaat en gedrag wordt opgenomen gedurende de sessie. Toegang tot een van de compartimenten is gekoppeld aan intracraniale lichtstimulatie. Onder de juiste lichtstimulatieparameters worden neuronen die een excitatory opsin uitdrukken, daardoor geactiveerd. Als de lichtstimulatie als lonend wordt ervaren, blijft de optogeneticamuis in het lichtgekoppelde compartiment, terwijl als de lichtstimulatie als aversief wordt ervaren, de muis het compartiment verlaat om aan de stimulatie te ontsnappen. Dit type analyse maakt het mogelijk voor de beoordeling van voorwaardelijke leren: Het onderwerp kan leiden tot lichtstimulatie en dus neuronale activering door het invoeren van een compartiment, en stop de stimulatie door het verlaten van het compartiment, vergelijkbaar met hendel-drukken tijdens een instrumentale taak. Bovendien kunnen associatieve leermechanismen worden beoordeeld tijdens volgende sessies waarin de tijd die in elk compartiment wordt doorgebracht wordt gemeten zonder stimulatie. Op deze manier kan de onderzoeker zich distantiëren tussen de onmiddellijk lonende effecten op stimulatie van de neuronen van belang en de associatieve geheugenvorming gerelateerd aan het12.
In de huidige studie beschrijven we twee stapsgewijze installatieprotocollen voor optogenetica-gedreven plaatsvoorkeursgedrag van vrij bewegende muizen. Het eerste protocol beschrijft RT-PP binnen een apparaat met drie compartimenten en is beschreven op basis van de protocollen die onlangs door Root en collega’s13 en andere auteurs12,14,15,16,17,18. Het experiment bestaat uit twee fasen bestaande uit verschillende dagelijkse sessies (weergegeven in figuur 1A). Elke sessie is ontworpen voor verschillende doeleinden en de parameters van koppelingstimulatie met een compartiment worden dienovereenkomstig gewijzigd. De eerste sessie, de “Pretest“, wordt gebruikt om de eerste voorkeur van het onderwerp te beoordelen op een van de compartimenten. Terwijl het onderwerp is aangesloten op het patchkoord, mag het apparaat vrij verkennen zonder stimulatie gedurende 15 min. Als de initiële voorkeur voor een compartiment meer dan 80% is, wordt de muis uitgesloten van de analyse, omdat de eerste zijbias de analyse kan scheeftrekken. Na de “Pretest“, begintfase 1. Het eerste deel bestaat uit twee opeenvolgende, dagelijkse, 30 min sessies van “RT-PP“. Tijdens “Fase 1” wordt de optogeneticamuis via het patchkoord verbonden met de laserbron en in de arena geplaatst om deze vrij te verkennen. De muis krijgt intracraniële laserstimulatie bij binnenkomst in een van de hoofdcompartimenten. Pilot experimenten kunnen worden uitgevoerd om te bepalen welk compartiment zal worden toegewezen als laser-paired en die als ongepaard. Als blijkt dat de stimulatie lonend is, wordt de laser gekoppeld aan het minst geprefereerde compartiment tijdens de “Pretest” en aan de meest geprefereerde als de stimulatie aversief is. Zo volgt het gepresenteerde RT-PP-protocol een bevooroordeeld ontwerp in de zin dat laserstimulatie niet willekeurig wordt toegewezen aan een van de twee hoofdcompartimenten (onbevooroordeeld ontwerp), maar wordt gekozen om een eerste voorkeur van de muis te vermijden. De toegang tot het andere hoofdcompartiment of het neutrale compartiment dat de twee hoofdcompartimenten met elkaar verbindt, leidt niet tot intracraniële lichtstimulatie en is dus niet licht gekoppeld. Deze sessies zorgen voor real-time beoordeling van de lonende of aversieve eigenschappen van stimulatie van specifieke neuronale populaties. Op de laatste dag van” Fase 1” vindt een 15 min sessie zonder enige stimulatie plaats. Deze sessie dient om geconditioneerde reacties (“CR“) aan te pakken die het gevolg zijn van associatief leren tussen de stimulatie en de omgeving waar het werd ontvangen. Ten minste drie dagen na “Fase 1” vindt de “Reversal Phase” plaats die dezelfde structuur volgt als ” Fase1“, maar het voorheen niet-gekoppelde hoofdcompartiment is nu gekoppeld aan lichte stimulatie. Zoals in het geval van “Fase 1“, worden de twee stimulatiesessies gevolgd door een “CR”sessie. De “Reversal Phase” wordt gebruikt om te bevestigen dat het gedrag van de muis afhankelijk is van optogenetische stimulatie en niet gerelateerd is aan willekeurige parameters. Elke sessie van het RT-PP experiment moet apart geprogrammeerd worden binnen de tracking software. Het huidige protocol beschrijft dergelijke instellingen binnen een specifieke software, maar alle andere tracking software in staat om transistor-transistor-logic (TTL) modulatie signalen te sturen naar de lichtbron kan worden gebruikt.
Het tweede protocol beschrijft een nieuwe setup aangeduid als de Neutrale Compartiment Voorkeur (NCP) paradigma. Dit gewijzigde protocol van de RT-PP maakt gebruik van de kleine omvang en transparantie van de verbindingscorridor die door de muis natuurlijk wordt vermeden vanwege de smalle en transparante samenstelling. Door beide hoofdcompartimenten te koppelen aan lichtstimulatie en de gang alleen vrij te laten van lichtstimulatie, kan de NCP-opstelling worden gebruikt om te testen of de optogenetische stimulatie de muis zal dwingen om meer tijd in de gang door te brengen om te voorkomen dat hij optogenetische stimulatie. Door de tijd die in de twee lichtgekoppelde compartimenten wordt doorgebracht te vergelijken met de tijd die in de gang wordt doorgebracht, kan een verificatie van optogenetisch veroorzaakte aversie worden gemaakt. Het NCP-experiment bestaat uit twee opeenvolgende dagelijkse sessies waarbij optogeneticamuizen stimulatie (elk 30 min) krijgen om de voorkeur in real-time te meten, en één laservrije sessie (15 min) om geconditioneerde reacties op dezelfde manier te beoordelen als die in de RT-PP Protocol.
De RT-PP en NCP protocollen hieronder werden onlangs gevalideerd in ons lab in de studie van hoe verschillende soorten neuronen gelegen in de ventrale tegmental gebied (VTA) zijn betrokken bij verschillende aspecten van beloning-gerelateerd gedrag12. Hier, om de implementatie van de RT-PP en NCP protocollen, dopamine transporter (DAT)-Cre19 en vesicular glutamaat transporter 2 (VGLUT2)-Cre20 transgene muizen stereotactisch geïnjecteerd met AAV het dragen van een floxed channelrhodopsin2 (ChR2) DNA-constructie in de VTA waarna een glasvezel werd geïmplanteerd boven de VTA. Gedragsreacties verkregen bij analyse van deze muizen met behulp van de meegeleverde RT-PP en NCP protocollen laat zien hoe activering van dopaminerge en glutamatere neuronen binnen de VTA leidt tot verschillende gedragsreacties(figuur 1).
Stap-voor-stap protocollen voor RT-PP en NCP paradigma’s worden voorzien van informatie variërend van genotyping van transgene muizen, stereotaxic virale injecties en fiberoptic afstandsbediening, tot het programmeren van tracking software voor laser-controle en gedragsgedrag Beoordeling. Daarnaast worden suggesties voor wijzigingen van het protocol besproken op het gebied van stimulatieparameters en experimentele aspecten die van invloed kunnen zijn op de wetenschappelijke uitkomst. Hoewel protocollen worden beschreven in de context van de VTA, kunnen ze worden toegepast op elk hersengebied of neuronale populatie, mits de relevante optogeneticatools, zoals relevante Cre-driver en floxed opsins, beschikbaar zijn.
In de huidige studie presenteren we twee stapsgewijze protocollen voor het uitvoeren van verschillende soorten plaatsvoorkeursanalyses met behulp van optogenetica bij muizen. De geschetste protocollen werden gebruikt om de lonende of aversieve gedragsfenotypes van VTA-neuronen(figuur 1 pt figuur 6)12te beoordelen, maar kunnen ook worden gebruikt om de gedragsrol van neuronen in andere hersengebieden te onderzoeken.
Verschillende recente studies hebben beschreven RT-PP paradigma’s in twee-compartiment23,24 en drie-compartiment apparaten13,14,15,16,17,18. De huidige protocollen beschrijven gedetailleerde opstellingen voor de RT-PP- en NCP-protocollen in een apparaat met drie compartimenten dat lijkt op die welke traditioneel worden gebruikt in CPP-experimenten om gedragseffecten op de toediening van drugs van misbruik te beoordelen. Hoewel de resultaten hier alleen worden gepresenteerd als het percentage tijd dat de muis in elk compartiment heeft doorgebracht, maakt de trackingsoftware het mogelijk om verschillende andere gedragsparameters te analyseren, zoals overgangen naar zones, snelheid, tijd die immobiel en meer wordt doorgebracht. Analyse van verschillende parameters kan van belang zijn voor de interpretatie van gegevens.
De huidige RT-PP protocollen zijn flexibel en kunnen worden aangepast om te testen of verschillende soorten stimulatiepatronen lonende effecten hebben. De parameters van laserbesturing kunnen eenvoudig worden gewijzigd door het script van het microcontrollerbord of binnen de trackingsoftware, wat de veelzijdigheid van de setup aantoont. We stellen een 20 Hz stimulatiefrequentie voor die binnen het bereik ligt, en soms lager, van frequenties die in eerdere studies zijn toegepast met dezelfde opsinvariant (ChR2/H134R) om dopaminerge en glutamaterneuronen en hun terminals13,14,16,17,18,23,24,25,26,27te bestuderen. Recente studies hebben aangetoond dat hogere stimulatiefrequenties de tegenovergestelde effecten op gedrag kunnen hebben dan lagere, en dat deze effecten worden bemiddeld door een depolarisatieblok veroorzaakt door hogere frequenties28. Op dezelfde manier zijn verschillen in gedragsoutput aangetoond bij het stimuleren van glutamatergic en GABAergic neuronen in het laterale preoptische gebied15. Deze studies onderzochten neuronen van verschillende gebieden dan de VTA en de grootste effecten werden waargenomen op hoge frequenties van niet-glutamaterende neuronen15,28. Onze keuze op 20 Hz is gebaseerd op eerdere studies van glutamaterende en dopaminerge VTA neuronen waaruit blijkt dat door verschillende stimulatiefrequenties, beloning-gerelateerde gedragsoutput niet significant wordt gewijzigd24,26.
Een extra parameter die kan worden aangepast en die de experimentele uitkomst kan beïnvloeden, is de kracht van de lichtbron. Hogere laserkracht kan de grootte van het licht gestimuleerde gebied vergroten, wat gunstig kan zijn in sommige soorten experimenten, maar met het nadeel van een stijging van temperatuur5. Inderdaad, een recente studie heeft aangetoond dat laser-geïnduceerde stijgingen van de temperatuur kan veranderen fysiologie van de hersenen en beïnvloeden gedragsmetingen29. Deze opmerkingen benadrukken het belang van het opnemen van opsin-negatieve controles in het experimentele ontwerp. In het huidige protocol gebruikten we 10 mW laserkracht die vergelijkbaar is en eerder is aangetoond effectief te zijn in het stimuleren van dopaminerge en glutamaterende neuronen in de VTA16,24,26. Bij het opzetten van experimenten is het belangrijk om aandacht te besteden aan de grootte van het gebied waarin de cellen van belang zich bevinden en de vezel-optica en patch koord eigenschappen (numerieke diafragma, kerndiameter). Deze parameters zijn essentieel om rekening mee te houden bij het uitvoeren van berekeningen met betrekking tot laserkracht. Voor meer informatie kan de rekenmachine ontwikkeld worden door het lab van Karl Deisseroth(http://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php)worden gebruikt.
Histologische verificatie van de Cre-Lox recombinatie is een ander cruciaal aspect bij het toepassen van optogenetica experimenten. Validatie van de recombinatie-efficiëntie moet altijd plaatsvinden in een pilotcohort voordat gedragsexperimenten in een grote groep dieren worden uitgevoerd. Dit is belangrijk om ethische redenen, maar ook voor geoptimaliseerde experimentele output. Elke virale constructie kan variabele specificiteit voor verschillende neuronale types en in verschillende regio’s5,een parameter die de experimenten kan beïnvloeden op onvoorspelbare en zelfs misleidende manieren. Zo hebben we eerder het Cre-Lox recombinatiepatroon van AAV5-virussen in de VTA van DAT-Cre muizen gevalideerd en vastgesteld dat unilaterale injecties voldoende waren om het grootste deel van het interessegebied te bereiken. Toen we vervolgens ruimtelijk beperkte subpopulaties binnen de VTA bestudeerden, zoals een die wordt gekenmerkt door NeuroD6-expressie, merkten we op dat bilaterale virale injecties efficiënter waren om een groter aantal neuronen te targeten die meer uitgesproken gedragseffecten geven op optogenetische lichtstimulatie12. Bovendien moet de tijd van chirurgie tot initiatie van gedragsexperimenten zorgvuldig worden aangepakt. Twee weken is genoeg tijd voor een ChR2 DNA-constructie worden uitgedrukt in cellichamen zoals we hier laten zien, maar langere wachttijden (~ 8 weken) nodig zou kunnen zijn als de onderzoeker is het testen van het effect van stimulatie in projectie gebieden13,14,15,17.
Het is vermeldenswaard dat het volume van het geïnjecteerde virus (in ons geval 300 nL) geschikt zou kunnen zijn bij het bestuderen van neuronen in de VTA, maar volume en titer moeten worden aangepast, afhankelijk van de efficiëntie van transductie en de grootte van de bestudeerde structuur. Bovendien kan het voor bilaterale structuren op een afstand van de mediolaterale as nodig zijn bilaterale injecties uit te voeren en ook glasvezel bilateraal te implanteren om activering/remming in beide hemisferen te garanderen.
Ten slotte is het altijd noodzakelijk om postmortem histologische analyse uit te voeren om de efficiëntie van de Cre-Lox recombinatie te valideren en te bevestigen en de juiste implantatieplaats van de optische vezel op de beoogde locatie te verifiëren. Onverwachte, overbeperkte of overmatige Cre-Lox recombinatie kan optreden als gevolg van onbekende verdeling van neuronen uitdrukken Cre buiten de grenzen van het beoogde gebied, of als gevolg van verschillen in het virus serotype, slechte behandeling van het virus, verstopping van de spuit voor de levering van virussen of andere operatie-gerelateerde problemen. Verificatie van bevredigende Cre-Lox recombinatie en correcte fiberoptica-implantatie moet worden uitgevoerd om eventuele statistische resultaten van de gedragsbeoordelingen te bevestigen om veilige conclusies te trekken.
In termen van de hier verstrekte gegevens als voorbeelden van hoe de twee gedragsparadigma’s kunnen worden gebruikt, werd de significante voorkeur aan de licht-gekoppelde kant die door optogenetische stimulatie van dopaminerge neuronen in VTA door het analyseren van dat-Cre muizen in het paradigma RT-PP wordt verkregen verwacht gebaseerd op vorige bevindingen23,24,25,26,27 terwijl het vermijden van deze kant die door de vglut2-Cre muizen wordt getoond niet werd verwacht. VGLUT2 neuronen van de VTA en hun projecties zijn aangetoond betrokken te zijn bij zowel beloning en aversie16,17,24,30,31, en we hebben daarom de NCP-analyse uitgevoerd om het schijnbare vermijdingsgedrag dat in de huidige RT-PP-opstelling wordt waargenomen, nader te beoordelen. Door gebruik te maken van de smalle, transparante gang als het enige niet-licht gekoppelde compartiment om de aversieve eigenschappen van stimulatie van VTA glutamateren te bevestigen, is het duidelijk dat in deze specifieke opstelling met drie compartimenten, optogenetische activering van deze neuronen een aversieve reactie veroorzaakt. Deze experimenten, waarvan hier werd aangetoond dat ze een voorbeeld zijn van situaties die baat zouden kunnen hebben bij het gebruik van zowel de RT-PP- als de NCP-protocollen, maakten deel uit van een onlangs gepubliceerde studie, en de volledige gegevensset en discussies over deze bevindingen zijn te vinden in deze publicatie12.
Naast het NCP zijn alternatieve manieren om aversie te bevestigen de sterke verlichting van een gebied binnen een open veldgebied terwijl de rest van de arena wordt gekoppeld aan laseractivering, of een actieve vermijdingstaak uitvoeren waarbij de muis een specifiek gedragspatroon moet uitvoeren om de laserstimulatie te beëindigen15.
Om samen te vatten, de beschreven protocollen bieden kritische informatie over hoe met succes uit te voeren RT-PP en NCP analyse op de meest efficiënte manier om de rol van neuronale activering in beloning en afkeer te ontrafelen. Afhankelijk van de wetenschappelijke hypothese kan een reeks parameters worden geanalyseerd met behulp van deze protocollen, en elk protocol kan ook worden gecombineerd met andere gevalideerde paradigma’s voor geoptimaliseerde gedragsanalyses die optogenetica implementeren om specifieke hersenen aan te pakken gebieden en neuronen van belang.
The authors have nothing to disclose.
Onze financieringsbronnen worden dankbaar erkend: Uppsala University, Vetenskapsrådet (Swedish Research Council), Hjärnfonden, Parkinsonfonden, de Research Foundations of Bertil Hållsten, OE&Edla Johansson, Zoologisk Forskning en Åhlén. De dieren werden gehouden aan de Universiteit van Uppsala en experimenten werden uitgevoerd in de Uppsala University Behavioral Facility.
AAV-Cre dependent virus | UNC Vector Core | – | a great variety of viruses to suit any project's needs |
Agarose | VWR Life Science | 443666A | |
Buffer for PCR | KAPA BIOSYSTEMS | KB1003 | 10x, contains 1.5mM MgCl2 at 1x |
Bupivacaine (Marcain) | Aspen | N01BB01 | local anesthetic, 5 mg/ml solution, requires prescription |
Carprofen (Norocarp) | N-Vet | 27636 | anti-inflammatory, analgesic; 50 mg/ml solution, requires prescription |
dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | 100mM, have to be dilluted to 10mM and mixed |
DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | SM0243 | 100 bp, 50 μg Gene Ruler |
DNA loading dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | 6x, dilute to 1x before using |
Ear puncher | AgnThos | AT7000 | ear puncher to take tissue samples for PCR or to mark animals |
Fiberoptic patchcords | Doric Lenses | MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25 | |
Implantable fiberoptics | Doric Lenses | MFC_200/245-0.37_5mm_ZF1.25_FLT | the properties of the fibers might change depending on the experiment |
Infusion pump for virus injections | AgnThos | Legato 130 | contains remote pump to secure the syringe directly on the stereotexi frame |
Isoflurane (Forane) | Baxter | N01AB06 | Volatile anesthetic, requires prescription |
Jewelry screws | AgnThos | MCS1x2 | |
Laser source | Marwell Laser Systems | CNI MBL-III-473-100mW | |
Microcontroller board | Arduino | "Uno" board | can be ordered from several companies |
Microdrill | AgnThos | 1474 | could be ordered with or without stereotaxic holder |
Needle (34G) | World Precision Instruments | NF36BV | |
Nucleic Acid gel stain – GelRed | Biotium | 41003-T | |
PCR tubes | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
Power meter | Thorlabs | PM100D | |
Place Preference Apparatus | Panlab | 76-0278 | |
Rotary joint | Doric Lenses | FRJ_1x1_FC-FC | |
Sleeves | Doric Lenses | SLEEVE_ZR_1-25 | mating sleeve to connect the patchcord with the implanted optic fiber |
Stabilization cement | Ivoclar Vivadent | Tetric EvoFlow | |
Syringe (10ul) | World Precision Instruments | NanoFil | |
Taq polymerase | KAPA BIOSYSTEMS | KE1000 | 500U |
TAE buffer | Omega BIO-TEK | SKU:AC10089 | 50x concentration, has to be dilluted before use |
Thermal cycler | BIO-RAD S1000 | 1852148 | necessary to perfrom PCR reactions |
Tissue glue | AgnThos | Vetbond | |
Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
TTL box | Noldus | Noldus USB-IO box | |
UV transilluminator | Azure Biosystems | c200 model |