Här tillhandahåller vi protokoll för att utföra tre enkla skadeinducerade axondegeneration (axon död) analyser i Drosophila melanogaster att utvärdera morfologiska och funktionella bevarande av avhuggna axoner och deras synapser.
Axon degeneration är en gemensam egenskap i neurodegenerativa sjukdomar och när nervsystemet utmanas av mekaniska eller kemiska krafter. Vår förståelse av de molekylära mekanismer som ligger till grund för axondegeneration är dock fortfarande begränsad. Skadeinducerad axondegeneration fungerar som en enkel modell för att studera hur avhuggna axoner utför sin egen demontering (axondöd). Under de senaste åren har en evolutionärt bevarad axon död signalering kaskad identifierats från flugor till däggdjur, vilket krävs för separerade axon att urarta efter skada. Omvänt resulterar försvagad axondödsignalering i morfologisk och funktionell konservering av avskurna axoner och deras synapser. Här presenterar vi tre enkla och nyligen utvecklade protokoll som möjliggör observation av axonal morfologi, eller axonal och synaptisk funktion av avhuggna axoner som har cut-off från neuronal cellkroppen, i fruktflugan Drosophila. Morfologi kan observeras i vingen, där en partiell skada resulterar i axon död sida vid sida av oskadade kontroll axoner inom samma nerv bunt. Alternativt kan axonal morfologi också observeras i hjärnan, där hela nervbunten genomgår axondöd som utlöses av antennal ablation. Funktionellt bevarande av avhuggna axoner och deras synapser kan bedömas genom en enkel optogenetisk strategi i kombination med en post-synaptisk grooming beteende. Vi presenterar exempel med hjälp av en highwire förlust-of-function mutation och genom att över-uttrycka dnmnat, båda kan fördröja axon död i veckor till månader. Viktigt är att dessa protokoll kan användas utöver skada. de underlättar karakterisering av neuronala underhållsfaktorer, axonal transport och axonal mitokondrierna.
Den morfologiska integriteten hos nervceller är avgörande för ihållande nervsystemet funktion under hela livet. Den stora majoriteten av den neuronala volymen tas av axons1,2; därmed är livslångt underhåll av särskilt långa axoner en stor biologisk och bioenergisk utmaning för nervsystemet. Flera axonal-inneboende och glia-extrinsic stödmekanismer har identifierats, vilket garanterar livslång axonal överlevnad. Deras nedskrivning resulterar i axon degeneration3, vilket är ett vanligt inslag i nervsystemet utmanas i sjukdom, och av mekaniska eller kemiska krafter4,5. De underliggande molekylära mekanismerna för axondegeneration är dock fortfarande dåligt förstådda i alla sammanhang, vilket gör utvecklingen av effektiva behandlingar för att blockera axonförlust utmanande. Utvecklingen av effektiva terapier mot dessa neurologiska tillstånd är viktig, eftersom de skapar en enorm börda i vårt samhälle6.
Skadeinducerad axondegeneration fungerar som en enkel modell för att studera hur avhuggna axoner utför sin egen demontering. Upptäcktes av och uppkallad efter Augustus Waller 1850, Wallerian degeneration (WD) är ett paraply term som omfattar två distinkta, molekylärt separable processer7. Först, efter axonal skada, axons separeras från sina cellkroppar aktivt utföra sin egen självförstörelse (axon död) genom en evolutionärt bevarad axon död signalering kaskad inom en dag efter skada8. För det andra, kring glia och specialiserade fagocyter engagera och rensa den resulterande axonal skräp inom tre till fem dagar. Dämpningen av axon död signalering resulterar i avhuggna axoner som förblir bevarade i veckor9,10,11,12, medan dämpning av glial uppslukande kulminerar i axonal skräp som kvarstår i veckor in vivo13,14,15.
Forskning i flugor, möss, råttor och zebrafiskar visade flera evolutionärt bevarade och väsentliga medlare av axon död signalerar8. Axon död mutanter innehåller avhuggna axoner och synapser som misslyckas med att genomgå axon död; de förblir morfologiskt och funktionellt bevarade i veckor, i avsaknad av kroppsstöd9,10,12,13,16,17,18,19,20,21,22,23.23 Upptäckten och karakteriseringen av dessa medlare ledde till definitionen av en molekylär väg som verkställer axondöd. Viktigt är att axon död signalering aktiveras inte bara när axonen skärs, krossas eller sträcks24,25; Det verkar också vara en bidragsgivare i olika djurmodeller av neurologiska tillstånd (t.ex. där axoner urarta på ett skadeoberoende sätt4, men med en rad positiva resultat4,8). Därför kan förstå hur axon död utför axon degeneration efter skada erbjuda insikter utöver en enkel skademodell; Det skulle också kunna ge mål för terapeutisk intervention.
Fruktflugan Drosophila melanogaster (Drosophila) har visat sig vara ett ovärderligt system för axon död signalering. Forskning i farten visade fyra väsentliga evolutionärt bevarade axon död gener: highwire (hiw)11,14, dnmnat12,26, dsarm10 och axundead (yxade)12. Ändringen av dessa medlare – förlust-of-function mutationer av hiw, dsarm och yxade, och över-uttryck för dnmnat – blockerar potent axon död under flyens livslängd. Medan avhuggna vilda typ axoner genomgår axon död inom 1 dag, avhuggna axoner och deras synapser saknas hiw, dsarm eller yxade förblir inte bara morfologiskt, men också funktionellt bevaras i veckor. Huruvida funktionell konservering också kan uppnås genom höga nivåer av dnmnat återstår att fastställa.
Här kommer vi att presentera tre enkla och nyligen utvecklade protokoll för att studera axondöd (t.ex. morfologi och funktion av avhuggna axoner och deras synapser över tiden) i avsaknad av cellkroppsstöd. Vi visar hur försvagad axondöd resulterar i avhuggna axoner som morfologiskt bevaras med en hiw förlust-of-function mutation (hiw∆N)och hur försvagad axon död resulterar i avhuggna axoner och synapser som förblir funktionellt bevarade i minst 7 dagar med över-uttryck av dnmnat (dnmnatOE). Dessa protokoll möjliggör observation av enskilda axonal och synaptisk morfologi antingen i centrala, eller perifera nervsystemet (CNS och PNS, respektive)13,14, medan funktionellt bevarande av avhuggna axoner och deras synapser i CNS kan visualiseras med hjälp av en enkel optogenetisk setup i kombination med grooming som en beteendemässig urläsning12.
De protokoll som beskrivs här möjliggör robust och reproducerbar observation av morfologi samt funktion av axoner och deras synapser separerade från sina cellkroppar i Drosophila. Vinganalysen underlättar observationen av axondöd sida vid sida av oskadade kontrollaxoner i PNS14, medan den antennala analysen underlättar observationav hela nervbuntar av GFP-märkta axoner och deras synapser, för att bedöma både morfologi och funktion i hjärnan (CNS)12. Det finns kritiska steg och vissa fördelar för varje metod för att studera morfologi som måste beaktas vid utformningen av experiment.
För att observera axonmorfologi i PNS i vingen, experiment kan lätt utföras, på grund av insynen i vingen: det gör det möjligt att kringgå dissekering och immunohistochemistry. Men på grund av bristen på fixering måste vingarna avvisas omedelbart efter montering14. För närvarande är två distinkta Gal4 förare används ofta, antingen ok371Gal4 eller dpr1Gal4, och båda referenserna erbjuder olika metoder för att kvantifiera degeneration14,26. Gles märkning av några nervceller rekommenderas, med hjälp av “Mosaic Analys med en förtrycklig cell Markör (MARCM)”14,31, som upplösningen av axonal morfologi saknar motstycke. Däremot är observation av synapser inte möjligt i vingar, de ligger i den ventrala nervsladden inuti flugornas bröstkorg. Dessutom kan ytterligare axonalmarkörer inte visualiseras genom immunohistokemi: den vaxartade nagelbanden gör det omöjligt för spridning av fixativ och antikroppar i den underliggande vävnaden.
För att observera axon och synapsmorfologi i CNS måste hjärndissektioner utföras. De erbjuder fördelen att visualisera ytterligare axonal och synaptiska markörer med hjälp av immunohistochemistry, och synapser kan observeras tillsammans axoner i samma synfält10,13. En stor samling av kännetecknas luktreceptorn (ORN) Gal4 drivrutiner är lätt tillgängliga32, och ofta, OR22aGal4 är föraren val. För antennal ablation, cellkroppar av OR22a nervceller är inrymt i3: e segmentet (figur 2B). En fluorescensintensitetsbaserad kvantifiering används för att kvantifiera degeneration av antingen axoner eller synapser13. Omvänt, experiment är tidskrävande på grund av hjärnan dissekering och antikroppar färgning.
För att visualisera axonal och synaptisk funktion efter axotomy, optogenetik används för att utlösa antennal grooming: det fungerar som en avläsning för funktionellt bevarande av avhuggna axoner och deras synapser12. Groomingkretsen och motsvarande sensoriska, inter- och motoreuron Gal4-förare har beskrivits noggrant29,30. GMR60E02Gal4 etiketter en delmängd av Johnston’s organ (JO) sensoriska nervceller, som krävs och tillräckligt för grooming29,30. För antennal ablation, cellkroppar av JO nervceller är inrymt i 2antennal segmentet (Figur 2B). En optogenetisk inställning kan lätt byggas från grunden, eller en befintlig inställning justeras. Viktigt, experiment måste utföras i ett mörkt rum, och flyger därmed visualiseras med en infraröd (IR) LED spotlight. När du använder CsChrimson som kanal är det viktigt att förse maten med all trans-retinal och en röd LED-strålkastare för att aktivera JO nervceller29. Alternativt kan blå ljuskänsliga kanaler och en blå LED-strålkastare, eller TrpA1-kanalen och temperaturen användas för neuronal aktivering29,33. Kvantifieringen av grooming beteende har redan beskrivits12,29.
När dessa analyser används för att specifikt studera axon död, är det viktigt att notera att fenotyp av morfologisk eller funktionell bevarande bör vara robust över tiden. Det finns fall där axon död leder till en konsekvent men mindre uttalad fenotyp i morfologisk bevarande34,35, och om en sådan fenotyp översätter till funktionellt bevarande återstår att bestämma.
Axon död fenotyper har också observerats i nervceller under utvecklingen av Drosophila larver, där nerver krossades snarare än skadade11,23. Här fokuserade vi specifikt på vuxna Drosophila nervceller som avslutade utvecklingen. I detta sammanhang kan användningen av RNA-störningar36, eller vävnadsspecifik CRISPR/Cas937 lätt genomföras. Viktigt, ovanstående tekniker kan användas i en axon död oberoende sammanhang: de underlättar karakterisering av neuronala underhållsfaktorer38, axonal transport39, åldersberoende axonal mitokondrierna förändringar40, och morfologi av axonal mitokondri41.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka hela Neukomm labbet för bidrag. Detta arbete stöddes av en Swiss National Science Foundation (SNSF) biträdande professor utmärkelse (bidrag 176855), International Foundation for Research in Paraplegia (IRP, grant P180), SNSF Spark (bidrag 190919) och genom stöd från universitetet i Lausanne och institutionen för grundläggande neurovetenskaper (État de Vaud) till LJN.
Tweezers (high precision, ultra fine) | EMS | 78520-5 | Antennal ablation |
MicroPoint Scissors (5-mm cutting edge) | EMS | 72933-04 | Wing injury |
1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086.0000 | |
35mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900 | |
Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific™ | BB02400600A113MNT0 | |
Superfrost Microscope Slides | Thermo Scientific™ | AA00008032E00MNT10 | |
High-Sensitivity USB 2.0 CMOS Camera, 1280 x 1024, Global Shutter | Thorlabs | DCC1240M | Camera setup |
SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts | Thorlabs | SM1RR | |
25mm 1/1.2" C mount Lens | Tamron | M112FM25 | |
Adapter with External M27 x 0.5 Threads and Internal SM1 Threads | Thorlabs | SM1A36 | |
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 700 nm | Thorlabs | FELH0700 | |
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
SM1 Lens Tube Without External Threads, 1" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M10 | |
850 nm, 900 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA | Thorlabs | M850L3 | IR LED spotlight |
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M20 | |
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 850 nm | Thorlabs | FELH0850 | |
SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts | Thorlabs | SM1RR | |
660 nm, 940 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA | Thorlabs | M660L4 | Red LED spotlight |
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M20 | |
15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube | Thorlabs | KPS101 | LED control |
T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current | Thorlabs | LEDD1B | |
150 mm x 300 mm x 12.7 mm Aluminum Breadboard, M6 Double-Density Taps | Thorlabs | MB1530/M | Mount base |
Ø12.7 mm Universal Post Holder, Spring-Loaded Locking Thumbscrew, L = 75 mm | Thorlabs | UPH75/M | Mount, 3x (IR LED, red LED, cam) |
Ø1.20" Slip Ring for SM1 Lens Tubes and C-Mount Extension Tubes, M4 Tap | Thorlabs | SM1RC/M | |
Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 150 mm | Thorlabs | TR150/M | |
Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 40 mm | Thorlabs | TR40/M | |
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 5 mm Hex | Thorlabs | RA90/M | |
M6 x 1.0 Stainless Steel Cap Screw, 16 mm Long, Pack of 25 | Thorlabs | SH6MS16 | screws for mount onto base |
USB-6001 14-Bit 20 kS/s Multifunction I/O and NI-DAQmx | National Instruments | 782604-01 | Red LED spotlight controller |
20k Ohm 1 Gang Linear Panel Mount Potentiometer | TT Electronics/BI | P230-2EC22BR20K | fintuner for indicator |
IR (860nm) emitter, 100 mA radial | Osram | 475-1365-ND | Red light indicator |
cable | – | – | Misc |
All-trans retinal | Sigma | R2625 | |
Ethanol absolute | Vwr | 20821.296 | |
Halocarbon Oil 27 | Sigma | H8773 | |
Mowiol | Merk | 81381 | |
Paraformaldehyde | Sigma | F8775 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493 | |
Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning Corp | 4019862 | |
Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning Corp | 4019862 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Chicken anti-GFP antibodies | Rockland | 600-901-215 | Antibodies |
Goat Dylight anti-Chicken | Abcam | ab96947 | |
FM7a, B | BDSC | RRID:BDSC_785 | X chromosome |
FRT19A[hs-neo] | BDSC | RRID:BDSC_1709 | |
hiw[ΔN] | BDSC | RRID:BDSC_51637 | |
hs-FLP[12] | BDSC | RRID:BDSC_1929 | |
tub-Gal80[LL1] | BDSC | RRID:BDSC_5132 | |
w[1118] | BDSC | RRID:BDSC_3605 | |
20xUAS-IVS-CsChrimson::mVenus | BDSC | RRID:BDSC_55135 | 2nd chromosome |
5xUAS-Gal4[12B] | Kyoto | RRID:Kyoto_108492 | |
5xUAS-HA::dnmnat | BDSC | RRID:BDSC_39702 | |
5xUAS-mCD8::GFP[LL5] | BDSC | RRID:BDSC_5134 | |
ase-FLP[2d] | Freeman laboratory | Neukomm et al., 2014 (PNAS) | |
CyO | BDSC | RRID:BDSC_2555 | |
dpr1-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_25083 | |
OR22a-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_9952 | |
ey-FLP[6] | BDSC | RRID:BDSC_5577 | 3rd chromosome |
GMR60E02-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_39250 | |
TM3,Sb,e | BDSC | RRID:BDSC_3644 |