Her gir vi protokoller for å utføre tre enkle skadeinduserte aksondegenerasjon (axon død) analyser i Drosophila melanogaster for å evaluere morfologisk og funksjonell bevaring av avkuttede aksoner og deres synapser.
Axon degenerasjon er en felles funksjon i nevrodegenerativ sykdom og når nervesystemet utfordres av mekaniske eller kjemiske krefter. Vår forståelse av de molekylære mekanismene som ligger til grunn for aksondegenerasjon, er imidlertid fortsatt begrenset. Skadeindusert aksondegenerasjon fungerer som en enkel modell for å studere hvordan avkuttede aksoner utfører sin egen demontering (axon død). I løpet av de siste årene har en evolusjonært bevart akson dødsignalisering kaskade blitt identifisert fra fluer til pattedyr, noe som kreves for at den separerte aksonen skal degenerere etter skade. Omvendt, detenuated axon død signalering resulterer i morfologiske og funksjonelle bevaring av avskårne aksoner og deres synapser. Her presenterer vi tre enkle og nylig utviklede protokoller som tillater observasjon av aksonal morfologi, eller aksonal og synaptisk funksjon av avkuttede aksoner som har blitt avskåret fra nevronal cellekropp, i fruktfluen Drosophila. Morfologi kan observeres i vingen, hvor en delvis skade resulterer i axon død side om side av uskadet kontroll aksoner innenfor samme nerve bunt. Alternativt kan aksonal morfologi også observeres i hjernen, hvor hele nervebunten gjennomgår aksondød utløst av antenneablasjon. Funksjonell bevaring av avkuttede aksoner og deres synapser kan vurderes av en enkel optogenetisk tilnærming kombinert med en post-synaptisk grooming atferd. Vi presenterer eksempler ved hjelp av en highwire tap av funksjon mutasjon og ved å overuttrykke dnmnat, begge i stand til å forsinke axon død i uker til måneder. Viktigere, disse protokollene kan brukes utover skade; De letter karakteriseringen av nevronale vedlikeholdsfaktorer, aksonal transport og aksonal mitokondrier.
Den morfologiske integriteten til nevroner er avgjørende for vedvarende nervesystemet funksjon gjennom hele livet. Det store flertallet av det nevronale volumet er tatt av aksoner1,2; dermed livslang vedlikehold av spesielt lange aksoner er en stor biologisk og bioenergetic utfordring for nervesystemet. Flere aksonale iboende og glial-extrinsic støtte mekanismer er identifisert, noe som sikrer livslang aksonal overlevelse. Deres svekkelse resulterer i akson degenerasjon3, som er et vanlig trekk ved nervesystemet blir utfordret i sykdom, og av mekaniske eller kjemiske krefter4,5. Imidlertid forblir de underliggende molekylære mekanismene for aksondegenerasjon dårlig forstått i enhver sammenheng, noe som gjør utviklingen av effektive behandlinger for å blokkere aksonerstap utfordrende. Utviklingen av effektive terapier mot disse nevrologiske forholdene er viktig, da de skaper en enorm byrde i vårt samfunn6.
Skadeindusert aksondegenerasjon fungerer som en enkel modell for å studere hvordan avkuttede aksoner utfører sin egen demontering. Wallerian degeneration (WD) ble oppdaget av og oppkalt etter Augustus Waller i 1850, og er et paraplybegrep som består av to forskjellige, molekylært separerbare prosesser7. Først, etter aksonal skade, aksoner atskilt fra sine cellelegemer aktivt utføre sin egen selvdestruksjon (axon død) gjennom en evolusjonært bevart akson død signalering kaskade innen en dag etter skade8. For det andre, omkringliggende glia og spesialiserte phagocytes engasjere og fjerne den resulterende aksonal rusk innen tre til fem dager. Demling av aksonen død signalering resulterer i avskårne aksoner som forblir bevart i uker9,10,11,12, mens demling av glial engulfment kulminerer i aksonal rusk som vedvarer i uker in vivo13,14,15.
Forskning på fluer, mus, rotter og sebrafisk avslørte flere evolusjonært bevarte og essensielle meklere av aksondød signalering8. Axon død mutanter inneholder avkuttede aksoner og synapser som ikke klarer å gjennomgå axon død; de forblir morfologisk og funksjonelt bevart i uker, i fravær av celle kroppen støtte9,10,12,13,16,17,18,19,20,21,22,23. Oppdagelsen og karakteriseringen av disse meklerne førte til definisjonen av en molekylær vei som utfører aksondød. Viktigere, axon død signalering aktiveres ikke bare når aksonen er kuttet, knust eller strukket24,25; det synes også å være en bidragsyter i distinkte dyremodeller av nevrologiske tilstander (f.eks. hvor aksoner degenererer på en skadeuavhengig måte4, men med en rekke gunstige resultater4,8). Derfor kan det å forstå hvordan axondød utfører aksondegenerasjon etter skade, gi innsikt utover en enkel skademodell; det kan også gi mål for terapeutisk intervensjon.
Fruktfluen Drosophila melanogaster (Drosophila) har vist seg å være et uvurderlig system for axon død signalering. Forskning i fly viste fire essensielle evolusjonært bevarte akson død gener: highwire (hiw)11,14, dnmnat12,26, dsarm10 og aksondøde (axed)12. dsarm Modifikasjonen av disse meklerne – funksjonstap av hiw, dsarm og axed, og over-uttrykk av dnmnat – blokkerer axon død for flyens levetid. Mens avskårne vill type aksoner gjennomgå axon død innen 1 dag, avskårne aksoner og deres synapser mangler hiw, dsarm eller axed forblir ikke bare morfologisk, men også funksjonelt bevart i flere uker. Hvorvidt funksjonell bevaring kan også oppnås gjennom høye nivåer av dnmnat gjenstår å bli bestemt.
Her vil vi presentere tre enkle og nylig utviklede protokoller for å studere axon død (f.eks morfologi og funksjon av avkuttede aksoner og deres synapser over tid) i fravær av celle kroppen støtte. Vi viser hvordan fortenuert aksondød resulterer i avskårne aksoner som er morfologisk bevart med en hiw tap av funksjon mutasjon (hiwN) og hvordan attenuated axon død resulterer i avskårne aksoner og synapser som forblir funksjonelt bevart i minst 7 dager med over-uttrykk av dnmnat (dnmnatOE). Disse protokollene tillater observasjon av individuell aksonal og synaptisk morfologi enten i det sentrale eller perifere nervesystemet (henholdsvis CNS og PNS)13,14, mens funksjonell bevaring av avkuttede aksoner og deres synapser i CNS kan visualiseres ved bruk av et enkelt optogenetisk oppsett kombinert med grooming som en atferdsavlesning12.
Protokollene som er beskrevet her tillater robust og reproduserbar observasjon av morfologi samt funksjon av aksoner og deres synapser atskilt fra deres cellekropper i Drosophila. Vingeanalysen forenkler observasjonen av axondød side om side av uskadede kontrollaksoner i PNS14, mens anmantenneanalysen letter observasjonen av hele nervebunter av GFP-merkede aksoner og deres synapser, for å vurdere både morfologi og funksjon i hjernen (CNS)12. Det er kritiske skritt og visse fordeler for hver tilnærming til å studere morfologi som må tas i betraktning når du utformer eksperimenter.
For å observere aksinmorfologi i PNS i vingen, kan eksperimenter lett utføres, på grunn av gjennomsiktigheten av vingen: det gjør det mulig å omgå disseksjon og immunohistochemistry. Men på grunn av mangel på fiksering, må vingene avbildes umiddelbart etter montering14. For tiden brukes to forskjellige Gal4-drivere ofte, enten ok371Gal4 eller dpr1Gal4, og begge referansene tilbyr forskjellige tilnærminger for å kvantifisere degenerasjon14,26. Sparsom merking av noen nevroner anbefales, ved hjelp av Mosaic Analysis with a Repressible Cell (MARCM)14,31, da oppløsningen av aksonal morfologi er enestående. I motsetning er observasjon av synapser ikke mulig i vinger, de ligger i ventral nerveledningen inne i thoraxen til fluene. Videre kan ytterligere aksonale markører ikke visualiseres av immunohistochemistry: den voksaktige skjellaget gjør det umulig for diffusjon av fikseringsmidler og antistoffer inn i underliggende vev.
For å observere akson og synapse morfologi i CNS, må hjernedeksjoner utføres. De tilbyr fordelen av å visualisere flere aksonale og synaptiske markører ved bruk av immunohistochemistry, og synapser kan observeres sammen med aksoner i samme synsfelt10,13. En stor samling av karakterisert olfactory reseptor neuron (ORN) Gal4 drivere er lett tilgjengelig32, og ofte er OR22aGal4 driveren av valget. For antenneablasjon er cellelegemer av OR22a nevroner plassert i 3rd segmentet (Figur 2B). En fluorescensintensitetsbasert kvantifisering brukes til å kvantifisere degenerasjonen av enten aksoner eller synapser13. Omvendt er eksperimenter tidkrevende på grunn av hjernedisseksjon og antistofffarging.
For å visualisere aksonal og synaptisk funksjon etter axotomy, brukes optogenetikk til å utløse antennestell: det fungerer som en avlesning for funksjonell bevaring av avkuttede aksoner og deres synapser12. Grooming krets og tilsvarende sensoriske, inter- og motorneuron Gal4 drivere har blitt grundig beskrevet29,30. GMR60E02Gal4 merker en undergruppe av Johnstons organ (JO) sensoriske nevroner, som er nødvendige og tilstrekkelige til å pleie29,,30. For antenneablasjon er cellelegemer av JO-nevroner plassert i 2nd antennesegmentet (Figur 2B). Et optogenetisk oppsett kan lett bygges fra bunnen av, eller et eksisterende oppsett justert. Viktigere, eksperimenter må utføres i et mørkt rom, og fluer dermed visualisert med en infrarød (IR) LED spotlight. Når du bruker CsChrimson som kanal, er det avgjørende å levere maten med alle trans-retinal og en rød LED spotlight for å aktivere JO nevroner29. Alternativt kan blå lysefølsomme kanaler og en blå LED-spotlight, eller TrpA1-kanalen og temperaturen brukes til nevronal aktivering29,,33. Kvantifiseringen av pleieatferd er allerede beskrevet12,29.
Når disse analysene brukes til å spesifikt studere aksondød, er det viktig å merke seg at fenotypen av morfologisk eller funksjonell bevaring bør være robust over tid. Det er tilfeller der aksondød fører til en konsekvent, men mindre uttalt fenotype i morfologisk bevaring34,35, og om en slik fenotype oversettes til funksjonell bevaring gjenstår å bli bestemt.
Axon død fenotyper har også blitt observert i nevroner under utvikling av Drosophila larver, hvor nerver ble knust i stedet for skadet11,23. Her fokuserte vi spesielt på voksne Drosophila nevroner som fullførte utviklingen. I denne sammenheng kan bruk av RNA-interferens36, eller vevsspesifikk CRISPR/Cas937 lett implementeres. Viktigere, ovennevnte teknikker kan brukes i en akson død uavhengig kontekst: de letter karakterisering av nevronale vedlikeholdsfaktorer38, aksonal transport39, aldersavhengig aksonal mitokondrier endringer40, og morfologi av aksonal mitokondrier41.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke hele Neukomm-laboratoriet for bidrag. Dette arbeidet ble støttet av en Swiss National Science Foundation (SNSF) Assistant Professor Award (stipend 176855), International Foundation for Research in Paraplegia (IRP, grant P180), SNSF Spark (stipend 190919) og ved støtte fra Universitetet i Lausanne og Institutt for grunnleggende nevrovitenskap (État de Vaud) til LJN.
Tweezers (high precision, ultra fine) | EMS | 78520-5 | Antennal ablation |
MicroPoint Scissors (5-mm cutting edge) | EMS | 72933-04 | Wing injury |
1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086.0000 | |
35mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900 | |
Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific™ | BB02400600A113MNT0 | |
Superfrost Microscope Slides | Thermo Scientific™ | AA00008032E00MNT10 | |
High-Sensitivity USB 2.0 CMOS Camera, 1280 x 1024, Global Shutter | Thorlabs | DCC1240M | Camera setup |
SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts | Thorlabs | SM1RR | |
25mm 1/1.2" C mount Lens | Tamron | M112FM25 | |
Adapter with External M27 x 0.5 Threads and Internal SM1 Threads | Thorlabs | SM1A36 | |
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 700 nm | Thorlabs | FELH0700 | |
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
SM1 Lens Tube Without External Threads, 1" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M10 | |
850 nm, 900 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA | Thorlabs | M850L3 | IR LED spotlight |
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M20 | |
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 850 nm | Thorlabs | FELH0850 | |
SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts | Thorlabs | SM1RR | |
660 nm, 940 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA | Thorlabs | M660L4 | Red LED spotlight |
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M20 | |
15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube | Thorlabs | KPS101 | LED control |
T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current | Thorlabs | LEDD1B | |
150 mm x 300 mm x 12.7 mm Aluminum Breadboard, M6 Double-Density Taps | Thorlabs | MB1530/M | Mount base |
Ø12.7 mm Universal Post Holder, Spring-Loaded Locking Thumbscrew, L = 75 mm | Thorlabs | UPH75/M | Mount, 3x (IR LED, red LED, cam) |
Ø1.20" Slip Ring for SM1 Lens Tubes and C-Mount Extension Tubes, M4 Tap | Thorlabs | SM1RC/M | |
Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 150 mm | Thorlabs | TR150/M | |
Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 40 mm | Thorlabs | TR40/M | |
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 5 mm Hex | Thorlabs | RA90/M | |
M6 x 1.0 Stainless Steel Cap Screw, 16 mm Long, Pack of 25 | Thorlabs | SH6MS16 | screws for mount onto base |
USB-6001 14-Bit 20 kS/s Multifunction I/O and NI-DAQmx | National Instruments | 782604-01 | Red LED spotlight controller |
20k Ohm 1 Gang Linear Panel Mount Potentiometer | TT Electronics/BI | P230-2EC22BR20K | fintuner for indicator |
IR (860nm) emitter, 100 mA radial | Osram | 475-1365-ND | Red light indicator |
cable | – | – | Misc |
All-trans retinal | Sigma | R2625 | |
Ethanol absolute | Vwr | 20821.296 | |
Halocarbon Oil 27 | Sigma | H8773 | |
Mowiol | Merk | 81381 | |
Paraformaldehyde | Sigma | F8775 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493 | |
Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning Corp | 4019862 | |
Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning Corp | 4019862 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Chicken anti-GFP antibodies | Rockland | 600-901-215 | Antibodies |
Goat Dylight anti-Chicken | Abcam | ab96947 | |
FM7a, B | BDSC | RRID:BDSC_785 | X chromosome |
FRT19A[hs-neo] | BDSC | RRID:BDSC_1709 | |
hiw[ΔN] | BDSC | RRID:BDSC_51637 | |
hs-FLP[12] | BDSC | RRID:BDSC_1929 | |
tub-Gal80[LL1] | BDSC | RRID:BDSC_5132 | |
w[1118] | BDSC | RRID:BDSC_3605 | |
20xUAS-IVS-CsChrimson::mVenus | BDSC | RRID:BDSC_55135 | 2nd chromosome |
5xUAS-Gal4[12B] | Kyoto | RRID:Kyoto_108492 | |
5xUAS-HA::dnmnat | BDSC | RRID:BDSC_39702 | |
5xUAS-mCD8::GFP[LL5] | BDSC | RRID:BDSC_5134 | |
ase-FLP[2d] | Freeman laboratory | Neukomm et al., 2014 (PNAS) | |
CyO | BDSC | RRID:BDSC_2555 | |
dpr1-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_25083 | |
OR22a-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_9952 | |
ey-FLP[6] | BDSC | RRID:BDSC_5577 | 3rd chromosome |
GMR60E02-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_39250 | |
TM3,Sb,e | BDSC | RRID:BDSC_3644 |