Qui, forniamo protocolli per eseguire tre semplici saggi di degenerazione degli assoni indotta da lesioni (morte assonale) in Drosophila melanogaster per valutare la conservazione morfologica e funzionale degli assoni recisi e delle loro sinapsi.
La degenerazione degli assoni è una caratteristica condivisa nella malattia neurodegenerativa e quando i sistemi nervosi sono sfidati da forze meccaniche o chimiche. Tuttavia, la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base della degenerazione degli assoni rimane limitata. La degenerazione degli assoni indotta da lesioni funge da semplice modello per studiare come gli assoni recisi eseguono il proprio smontaggio (morte assonale). Negli ultimi anni, è stata identificata una cascata di segnalazione della morte degli assoni conservita evolutivamente dalle mosche ai mammiferi, che è necessaria per la degenerazione dell’assone separato dopo la lesione. Al contrario, la segnalazione attenuata della morte degli assoni si traduce nella conservazione morfologica e funzionale degli assoni recisi e delle loro sinapsi. Qui, presentiamo tre protocolli semplici e recentemente sviluppati che consentono l’osservazione della morfologia assonale, o funzione assonale e sinaptica degli assoni mozzati che sono stati tagliati fuori dal corpo cellulare neuronale, nel filo della frutta Drosophila. La morfologia può essere osservata nell’ala, dove una lesione parziale provoca la morte di assoni fianco a fianco degli assoni di controllo illesi all’interno dello stesso fascio di nervi. In alternativa, la morfologia assonale può essere osservata anche nel cervello, dove l’intero fascio di nervi subisce la morte degli assa innescata dall’ablazione delle antenne. La conservazione funzionale degli assoni recisi e delle loro sinapsi può essere valutata con un semplice approccio optogenetico accoppiato con un comportamento di toelettatura post-sinaptico. Presentiamo esempi utilizzando una mutazione highwire loss-of-function e sovraesprimendo dnmnat,entrambi in grado di ritardare la morte di assoni per settimane o mesi. È importante sottolineare che questi protocolli possono essere utilizzati oltre le lesioni; facilitano la caratterizzazione dei fattori di mantenimento neuronale, del trasporto assonale e dei mitocondri assonali.
L’integrità morfologica dei neuroni è essenziale per la funzione sostenuta del sistema nervoso per tutta la vita. La stragrande maggioranza del volume neuronale è presa da assoni1,2; quindi il mantenimento per tutta la vita di assoni particolarmente lunghi è una grande sfida biologica e bioenergetica per il sistema nervoso. Sono stati identificati più meccanismi di supporto assonale-intrinseco e gliale-estrinseco, garantendo la sopravvivenza assonale per tutta la vita. La loro compromissione provoca la degenerazione degli assoni3, che è una caratteristica comune del sistema nervoso che viene sfidato nella malattia, e dalle forze meccaniche o chimiche4,5. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base della degenerazione degli assoni rimangono poco compresi in qualsiasi contesto, rendendo difficile lo sviluppo di trattamenti efficaci per bloccare la perdita degli assoni. Lo sviluppo di terapie efficaci contro queste condizioni neurologiche è importante, in quanto creano un enorme onere nella nostra società6.
La degenerazione degli assoni indotta da lesioni funge da semplice modello per studiare come gli assoni recisi eseguono il proprio smontaggio. Scoperto e intitolato ad Augustus Waller nel 1850, la degenerazione murale (WD) è un termine generico che comprende due processi distinti e molecolarmente separabili7. In primo luogo, dopo lesioni assonali, gli assoni separati dai loro corpi cellulari eseguono attivamente la propria autodistruzione (morte assonale) attraverso una cascata di segnalazione della morte degli assoni evolutivamente conservata entro un giorno dopo la lesione8. In secondo luogo, glia circostante e fagociti specializzati coinvolgono e ripulire i detriti assonali risultanti entro tre o cinque giorni. L’attenuazione della segnalazione della morte degli assoni si traduce in assoni recisi che rimangono conservati per settimane9,10,11,12, mentre l’attenuazione dell’inghiottimento gliale culmina in detriti assonali che persiste per settimane in vivo13,14,15.
La ricerca su mosche, topi, ratti e pesci zebra ha rivelato diversi mediatori evolutivamente conservati ed essenziali della segnalazione della morte degli assoni8. I mutanti della morte di Assoni contengono assoni recisi e sinapsi che non subiscono la morte degli assoni; rimangono morfologicamente e funzionalmente conservati per settimane, in assenza del supporto del corpo cellulare9,10,12,13,16,17,18,19,20,21,22,23. La scoperta e la caratterizzazione di questi mediatori hanno portato alla definizione di un percorso molecolare che esegue la morte dell’assonale. È importante sottolineare che la segnalazione della morte degli assoni viene attivata non solo quando l’assone viene tagliato, schiacciato o allungato24,25; sembra anche contribuire a modelli animali distinti di condizioni neurologiche (ad esempio, dove gli assoni degenerano in modo indipendente dagli infortuni4, ma con una serie di esiti benefici4,8). Pertanto, capire come la morte degli assoni esegua la degenerazione degli assoni dopo l’infortunio potrebbe offrire intuizioni al di là di un semplice modello di infortunio; potrebbe anche fornire obiettivi per l’intervento terapeutico.
Il filo della frutta Drosophila melanogaster (Drosophila) ha dimostrato di essere un sistema inestimabile per la segnalazione della morte degli assoni. La ricerca nel fly ha rivelato quattro geni essenziali della morte assonale evolutivamente conservati: highwire (hiw)11,14, dnmnat12,26, dsarm10 e axundead (axed)12. La modifica di questi mediatori – mutazioni di perdita di funzione di hiw, dsarm e axed, e over-expression di dnmnat – blocca potentemente la morte di assone per la durata della vita della mosca. Mentre gli assoni semolati subiscono la morte di assoni entro 1 giorno, gli assoni recisi e le loro sinapsi prive di hiw, dsarm o axed rimangono non solo morfologicamente, ma anche funzionalmente conservati per settimane. Resta da determinare se la conservazione funzionale può essere raggiunta anche attraverso elevati livelli di dnmnat.
Qui, presenteremo tre protocolli semplici e recentemente sviluppati per studiare la morte degli assoni (ad esempio, la morfologia e la funzione degli assoni recisi e delle loro sinapsi nel tempo) in assenza di supporto del corpo cellulare. Dimostriamo come la morte degli assoni attenuata si traduca in assoni recisi che sono conservati morfologicamente con una mutazione di perdita di funzione di hiw (hiw– N) e come la morte attenuata degli assoni si traduca in assoni recisi e sinapsi che rimangono funzionalmente conservati per almeno 7 giorni con sovraespressione di dnmnat ( dnatnm dnmnatOE). Questi protocolli consentono l’osservazione di singole morfologia assonale e sinaptica sia nel sistema nervoso centrale o periferico (CNS e PNS, rispettivamente)13,14, mentre la conservazione funzionale degli assoni recisi e delle loro sinapsi nel SNC può essere visualizzata con l’uso di una semplice configurazione optogenetica combinata con la lettura comportamentale12.
I protocolli qui descritti consentono l’osservazione robusta e riproducibile della morfologia, nonché la funzione degli assoni e delle loro sinapsi separate dai loro corpi cellulari in Drosophila. Il saggio dell’ala facilita l’osservazione della morte degli assoni fianco per lato degli assoni di controllo non feriti nel PNS14, mentre il saggio dell’antenna facilita l’osservazione di fasci integrali nervosi degli assoni etichettati Con GFP e delle loro sinapsi, per valutare sia la morfologia che la funzione nel cervello (CNS)12. Ci sono passaggi critici e alcuni vantaggi per ogni approccio allo studio della morfologia che devono essere presi in considerazione quando si progettano esperimenti.
Per osservare la morfologia degli assoni nel PNS nell’ala, gli esperimenti possono essere prontamente eseguiti, a causa della trasparenza dell’ala: permette di bypassare la dissezione e l’immunohistochimica. Tuttavia, a causa della mancanza di fissazione, le ali devono essere immagine subito dopo il montaggio14. Attualmente vengono utilizzati frequentemente due driver Gal4 distinti, ok371Gal4 o dpr1Gal4, ed entrambi i riferimenti offrono approcci distinti per quantificare la degenerazione14,26. Si raccomanda l’etichettatura sparse di alcuni neuroni, utilizzando “Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM)”14,31 ,poichéla risoluzione della morfologia assonale è senza precedenti. Al contrario, l’osservazione delle sinapsi non è possibile nelle ali, si trovano nel cordone nervoso ventrale all’interno del torace delle mosche. Inoltre, ulteriori marcatori assonali non possono essere visualizzati con immunohistochimica: la cuticola cerosa rende impossibile la diffusione di fissativi e anticorpi nel tessuto sottostante.
Per osservare la morfologia degli assoni e delle sinapsi nel SNC, devono essere eseguite dissezioni cerebrali. Offrono il vantaggio di visualizzare ulteriori marcatori assonali e sinaptici con l’uso di immunostochimica, e le sinapsi possono essere osservate insieme agli assoni nello stesso campo visivo10,13. Una vasta collezione di driver di neuroni del neurone del recettore olfattivo (ORN) Gal4 è prontamente disponibile32e spesso OR22aGal4 è il fattore di scelta. Per l’ablazione dell’antenna, i corpi cellulari dei neuroni OR22a sono alloggiati nel segmento 3rd (Figura 2B). Una quantificazione basata sull’intensità della fluorescenza viene utilizzata per quantificare la degenerazione degli assoni o delle sinapsi13. Al contrario, gli esperimenti richiedono molto tempo a causa della dissezione del cervello e della colorazione degli anticorpi.
Per visualizzare la funzione assonale e sinaptica dopo l’assiotomia, l’optogenetica viene utilizzata per attivare la toelettatura antenne: serve come lettura per la conservazione funzionale degli assoni recisi e delle loro sinapsi12. Il circuito di toelettatura e i corrispondenti driver sensoriali, interneuroni Gal4 sono stati accuratamente descritti29,30. GMR60E02Gal4 etichetta un sottoinsieme dei neuroni sensoriali dell’organo di Johnston (JO), necessari e sufficienti per la toelettatura29,30. Per l’ablazione dell’antenna, i corpi cellulari dei neuroni JO sono alloggiati nel segmento 2nd dell’antenna (Figura 2B). Una configurazione optogenetica può essere facilmente costruita da zero, o una configurazione esistente regolata. È importante sottolineare che gli esperimenti devono essere eseguiti in una stanza buia e le mosche sono così visualizzate con un faretto a LED a infrarossi (IR). Quando si utilizza CsChrimson come canale, è fondamentale fornire al cibo tutto trans-retinale e un faretto LED rosso per attivare i neuroni JO29. In alternativa, i canali blu sensibili alla luce chiara e un faretto LED blu, o il canale e la temperatura TrpA1 possono essere utilizzati per l’attivazione neuronale29,33. La quantificazione del comportamento di toelettatura è già stata descritta12,29.
Quando questi saggi sono utilizzati per studiare specificamente la morte degli assoni, è importante notare che il fenotipo della conservazione morfologica o funzionale dovrebbe essere robusto nel tempo. Ci sono casi in cui la morte assonale porta ad un fenotipo coerente ma meno pronunciato nella conservazione morfologica34,35, e se tale fenotipo si traduce in conservazione funzionale rimane da determinare.
I fenotipi di morte ascia sono stati osservati anche nei neuroni durante lo sviluppo delle larve della Drosophila, dove i nervi sono stati schiacciati piuttosto che feriti11,23. Qui, ci siamo concentrati specificamente sui neuroni adulti della Drosophila che hanno completato lo sviluppo. In questo contesto, l’uso dell’interferenza dell’RNA36, o del tessuto specifico CRISPR/Cas937 può essere facilmente implementato. È importante sottolineare che le tecniche di cui sopra possono essere utilizzate in un contesto indipendente dalla morte assonale: facilitano la caratterizzazione dei fattori di manutenzione neuronale38, il trasporto assonale39, i mitocondri assonali dipendenti dall’etàcambiano 40e la morfologia dei mitocondri assonali41.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo l’intero laboratorio Neukomm per i contributi. Questo lavoro è stato sostenuto da un premio Assistant Professor della Fondazione nazionale svizzera per la scienza nazionale (SNSF) (grant 176855), dalla Fondazione internazionale per la ricerca in paraplegia (IRP, grant P180), dalla SNSF Spark (grant 190919) e dal sostegno dell’Università di Losanna e il Dipartimento di Neuroscienze Fondamentali (Tat de Vaud) a LJN.
Tweezers (high precision, ultra fine) | EMS | 78520-5 | Antennal ablation |
MicroPoint Scissors (5-mm cutting edge) | EMS | 72933-04 | Wing injury |
1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086.0000 | |
35mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900 | |
Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific™ | BB02400600A113MNT0 | |
Superfrost Microscope Slides | Thermo Scientific™ | AA00008032E00MNT10 | |
High-Sensitivity USB 2.0 CMOS Camera, 1280 x 1024, Global Shutter | Thorlabs | DCC1240M | Camera setup |
SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts | Thorlabs | SM1RR | |
25mm 1/1.2" C mount Lens | Tamron | M112FM25 | |
Adapter with External M27 x 0.5 Threads and Internal SM1 Threads | Thorlabs | SM1A36 | |
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 700 nm | Thorlabs | FELH0700 | |
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
SM1 Lens Tube Without External Threads, 1" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M10 | |
850 nm, 900 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA | Thorlabs | M850L3 | IR LED spotlight |
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M20 | |
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 850 nm | Thorlabs | FELH0850 | |
SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts | Thorlabs | SM1RR | |
660 nm, 940 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA | Thorlabs | M660L4 | Red LED spotlight |
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M20 | |
15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube | Thorlabs | KPS101 | LED control |
T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current | Thorlabs | LEDD1B | |
150 mm x 300 mm x 12.7 mm Aluminum Breadboard, M6 Double-Density Taps | Thorlabs | MB1530/M | Mount base |
Ø12.7 mm Universal Post Holder, Spring-Loaded Locking Thumbscrew, L = 75 mm | Thorlabs | UPH75/M | Mount, 3x (IR LED, red LED, cam) |
Ø1.20" Slip Ring for SM1 Lens Tubes and C-Mount Extension Tubes, M4 Tap | Thorlabs | SM1RC/M | |
Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 150 mm | Thorlabs | TR150/M | |
Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 40 mm | Thorlabs | TR40/M | |
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 5 mm Hex | Thorlabs | RA90/M | |
M6 x 1.0 Stainless Steel Cap Screw, 16 mm Long, Pack of 25 | Thorlabs | SH6MS16 | screws for mount onto base |
USB-6001 14-Bit 20 kS/s Multifunction I/O and NI-DAQmx | National Instruments | 782604-01 | Red LED spotlight controller |
20k Ohm 1 Gang Linear Panel Mount Potentiometer | TT Electronics/BI | P230-2EC22BR20K | fintuner for indicator |
IR (860nm) emitter, 100 mA radial | Osram | 475-1365-ND | Red light indicator |
cable | – | – | Misc |
All-trans retinal | Sigma | R2625 | |
Ethanol absolute | Vwr | 20821.296 | |
Halocarbon Oil 27 | Sigma | H8773 | |
Mowiol | Merk | 81381 | |
Paraformaldehyde | Sigma | F8775 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493 | |
Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning Corp | 4019862 | |
Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning Corp | 4019862 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Chicken anti-GFP antibodies | Rockland | 600-901-215 | Antibodies |
Goat Dylight anti-Chicken | Abcam | ab96947 | |
FM7a, B | BDSC | RRID:BDSC_785 | X chromosome |
FRT19A[hs-neo] | BDSC | RRID:BDSC_1709 | |
hiw[ΔN] | BDSC | RRID:BDSC_51637 | |
hs-FLP[12] | BDSC | RRID:BDSC_1929 | |
tub-Gal80[LL1] | BDSC | RRID:BDSC_5132 | |
w[1118] | BDSC | RRID:BDSC_3605 | |
20xUAS-IVS-CsChrimson::mVenus | BDSC | RRID:BDSC_55135 | 2nd chromosome |
5xUAS-Gal4[12B] | Kyoto | RRID:Kyoto_108492 | |
5xUAS-HA::dnmnat | BDSC | RRID:BDSC_39702 | |
5xUAS-mCD8::GFP[LL5] | BDSC | RRID:BDSC_5134 | |
ase-FLP[2d] | Freeman laboratory | Neukomm et al., 2014 (PNAS) | |
CyO | BDSC | RRID:BDSC_2555 | |
dpr1-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_25083 | |
OR22a-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_9952 | |
ey-FLP[6] | BDSC | RRID:BDSC_5577 | 3rd chromosome |
GMR60E02-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_39250 | |
TM3,Sb,e | BDSC | RRID:BDSC_3644 |