İmmünofluoresans Mikroskobu kullanılarak Parafin Gömülü Kedi Arteriyel Trombisinde Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakların Belirlenmesi
Summary
Isıya bağlı antijen alma ve çift immün etiketleme protokolü kullanarak formaldehit sabit ve parafin gömülü kedi kardiyojenik arteriyel trombisinde nötrofil ekstrasellüler tuzaklarını (NET) tanımlamak için bir yöntem tanımladık.
Abstract
Hücresiz DNA (cfDNA) ve histones ve nötrofil elastaz (NE) gibi proteinlerden oluşan nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETs), sistemik inflamasyon veya patojenlere yanıt olarak nötrofiller tarafından salınır. Daha önce NET’lerin pıhtı oluşumunu artırıp insanlarda ve köpeklerde fibrinolizi inhibe kleri gösterilmiş olsa da, hipertrofik kardiyomiyopatiye sekonder yaşamı tehdit eden bir komplikasyon olan kardiyojenik arteriyel tromboemboli (CATE) olan kedilerde NET’lerin rolü , bilinmemektedir. Kedilerde kardiyojenik artertrombinde NET’leri tanımlamak ve ölçmek için standartlaştırılmış bir yöntem, CATE’deki patolojik rollerini anlamamızı sağlayacaktır. Burada, nekropsi sırasında çıkarılan aort bifurkasyonu içinde formaldehit-sabit ve parafin gömülü trombi de NETs tanımlamak için bir teknik açıklanmıştır. Ksilen ile deparafinizasyon dan sonra, aort bölümleri dolaylı ısı kaynaklı antijen alma yapıldı. Daha sonra kesitler bloke edildi, permeazize edildi ve ex vivo NET’ler hücresiz DNA (cfDNA), sitilinated histon H3 (citH3) ve nötrofil elastaz (NE) immünofloresan mikroskobu kullanılarak kolokalizasyonu ile tespit edildi. Trombide Nİt’lerin immünosaptasyonuna optimize etmek için doku elementlerinin otofloresansı mikroskopi den önce otofloresan söndürme işlemi ile sınırlandırıldı. Bu teknik, diğer türlerde NETs ve tromboz çalışma için yararlı bir araç olabilir ve bu karmaşık durumun patofizyolojisi içine yeni anlayışlar sunuyor.
Introduction
Hipertrofik kardiyomiyopatisi olan kediler hayatı tehdit eden tromboembolik komplikasyonlar riski altındadır1,2. Kedi kardiyojenik artertromboemboli (CATE) ile ilişkili yüksek morbidite ve mortaliteye rağmen, KEDILERDE CATE’in altta yatan patofizyolojisi tam olarak anlaşılamamıştır. Bu yıkıcı durum riski altında kedileri tedavi etmek ve tanımlamak için sınırlı tanı ve tedavi araçları da vardır3.
Nötrofillerin doğuştan gelen bağışıklıktaki rolüne ek olarak, nötrofillerin, nötrofil elastazı (NE) ve miyeloperoksidaz gibi histones ve granüler proteinler ile kaplanmış hücresiz DNA (cfDNA) ağları olan nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETs) serbest bırakarak trombozda rol oynadığı gösterilmiştir. Nötrofiller sistemik inflamasyona yanıt olarak NETs oluşumu, patojenler ile doğrudan karşılaşma ve aktif trombositlerileetkileşim 4,5,6,7. Köpeklerde nötrofil kaynaklı DNA’nın pıhtı lyzisini inhibe ettiği, NET proteinlerin ise pıhtı oluşumunu hızlandırdığı gösterilmiştir. NETs yeteneği sirkülasyon hücreleri ve pıhtılaşma bileşenleri tuzak da onların trombojenik özellikleri8,9,,10,11,12anahtarıdır.
NET’ler ekstrasellüler nötrofil proteinlerin, histones ve cfDNA’nın kolokalizasyonu ile saptanır. Bu nedenle, deparafinize dokuların immünororesans ile sabit dokularda NETs belirlenmesi ve nicelleştirilmesi parlak alan mikroskopisi 4 kullanarak geleneksel hematoksilin4ve eozin (H & E) leke üstündür 4,5. Immünororesans mikroskopisi kullanarak yapılan çeşitli insan çalışmaları, KORONER arter trombüsü, serebral inme trombozu, aterothrombosis ve venöz trombosit13,14,,15,1616,17yapısal bileşenleri olarak NETs tespit . Bugüne kadar, kedi trombositindeki NET’leri tespit etmek ve ölçmek için standart laştırılmış bir yöntem tanımlanmamıştır. Kedi kardiyojenik artertrombisinde NET’lerin belirlenmesi, NET’lerde ve trombozlarda gelecekteki çeviri araştırmalarını kolaylaştırabileceğinden, kedilerde parafin gömülü arteriyel trombide NET tanımlama ve değerlendirme tekniklerini açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz bir çift immünetiketleme protokolü ve immünororesans mikroskopisi kullanarak sabit kedi kardiyojenik arteriyel trombosit NETs tanımlamak için bir protokol açıklar. Sadece kardiyojenik arteriyel trombüs lekelenmiş olmasına rağmen, teoride bu protokol diğer trombüs türleri ve diğer veteriner türleri için kullanılabilir. Kedi artertrombinindeki NET’lerin belirlenmesi, kedilerde trombozda NET’lerin rol oynayabileceğini düşündürmektedir.
Sabit ve parafin gömülü dokuda…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma, Kaliforniya Üniversitesi, Davis, Companion Animal Health Merkezi ‘nden (CCAH 2018-30-F) gelen fonlar tarafından desteklendi. Yazarlar floresan mikroskobun kullanımı için Dr Kevin Woolard kabul etmek istiyorum.
Materials
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
Referências
- Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).
- Payne, J. R., et al. Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).
- Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012. Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review. Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Li, R., Tablin, F. A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis. Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).
- Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).
- Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis. Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).
- Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).
- Li, B., et al. Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).
- Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).
- Qi, H., Yang, S., Zhang, L. Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis. Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).
- Laridan, E., et al. Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi. Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).
- Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy. BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation. Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).
- Rait, V. K., Xu, L., O’Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).
- Willingham, M. C. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).
- Davis, A. S., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).
- Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method. Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).
- Ducroux, C., et al. Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
