Identificação de Armadilhas Extracelulares De Neutrófilos em Trombo Arterial Felino Embutido parafina usando Microscopia de Imunofluorescência
Summary
Descrevemos um método para identificar armadilhas extracelulares (NETs) em trombo cardiogênico felino fixo e parafinado de parafina usando recuperação de antígeno induzido pelo calor e um protocolo de rotulagem de dupla imunorotulagem.
Abstract
Armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), compostas de DNA livre de células (cfDNA) e proteínas como histonas e elastase de neutrófilos (NE), são liberadas por neutrófilos em resposta a inflamações sistêmicas ou patógenos. Embora os NETs tenham sido mostrados anteriormente para aumentar a formação de coágulos e inibir a fibrinolise em humanos e cães, o papel dos NETs em gatos com tromboembolismo arterial cardiogênico (CATE), uma complicação de risco de vida secundária à cardiomiopatia hipertrófica , é desconhecido. Um método padronizado para identificar e quantificar os NETs em trombos arteriais cardiogênicos em gatos avançará nossa compreensão de seu papel patológico no CATE. Aqui, descrevemos uma técnica para identificar NETs em trombos fixados em formaldeído e parafina dentro da bifurcação aórtica, extraídos durante a necropsia. Após a deparafinação com xileno, as seções aórticas foram submetidas à recuperação indireta de antígenos induzidos pelo calor. As seções foram então bloqueadas, permeabilizadas e ex-vivo NETs foram identificadas por colocalização de DNA livre de células (cfDNA), histona citrubilada H3 (citH3) e elastase neutrófilo (NE) utilizando microscopia de imunofluorescência. Para otimizar a imunodetecção de NETs em trombos, a autofluorescência dos elementos teciduais foi limitada por meio de um processo de saciedade de autofluorescência antes da microscopia. Essa técnica pode ser uma ferramenta útil para estudar NETs e trombose em outras espécies e oferece novas percepções sobre a fisiopatologia dessa condição complexa.
Introduction
Gatos com cardiomiopatia hipertrófica correm o risco de complicações tromboembólicas com risco de vida1,2. Apesar da alta morbidade e mortalidade associada ao tromboembolismo arterial cardiogênico felino (CATE), a fisiopatologia subjacente da CATE em gatos é mal compreendida. Existem também ferramentas diagnósticas e terapêuticas limitadas para tratar e identificar gatos em risco desta condição devastadora3.
Além de seu papel na imunidade inata, os neutrófilos têm mostrado desempenhar um papel na trombose, liberando armadilhas extracelulares de neutrófilos (NE), que são redes semelhantes à web de DNA livre de células (CFDNA) incrustadas com histones e proteínas granulares como elastase neutrófilo (NE) e mieloperoxidase. Os neutrófilos são submetidos à formação de NETs em resposta à inflamação sistêmica, encontro direto com patógenos e interação com plaquetas ativadas4,5,6,7. Em cães, o DNA derivado de neutrófilos tem sido mostrado para inibir a lise do coágulo, enquanto as proteínas NET aceleram a formação de coágulos. A capacidade dos NETs de prender células circulantes e componentes de coagulação também é fundamental para suas propriedades trombogênicas8,,9,,10,,11,,12.
Os NETs são detectados pela colocalização de proteínas neutrófilos extracelulares, histonas e cfDNA. Por isso, a identificação e quantificação de NETs em tecidos fixos por imunofluorescência de tecidos desparafinados é superior à hematoxilina tradicional e eosina (H&E) usando microscopia de campo brilhante4,5. Vários estudos em humanos utilizando microscopia de imunofluorescência identificaram os NETs como componentes estruturais do trombo arterial coronário, trombos de derrame cerebral, atherothrombose e trombosve venoso13,14,15,16,17. Até o momento, não foi descrito um método padronizado para detectar e quantificar OS TNS no trombo felino. Como a identificação de NETs no trombo arterial cardiogênico felino pode facilitar futuras pesquisas translacionais em NETs e trombose, descrevemos técnicas de identificação e avaliação de NET em trombos arterial sinuosa embutida em parafina em gatos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos um protocolo para identificar NETs em trombos arteriais cardiogênicos felinos fixos usando um protocolo de imunorotulagem dupla e microscopia de imunofluorescência. Embora apenas trombos arterials cardiogênicos estivessem manchados, em teoria este protocolo poderia ser usado para outros tipos de trombos e em outras espécies veterinárias. A identificação de NETs dentro do trombo arterial felino sugere que os NETs podem desempenhar um papel na trombose em gatos.
A detecção d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O estudo foi apoiado por fundos da Universidade da Califórnia, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Os autores gostariam de reconhecer o Dr. Kevin Woolard pelo uso do microscópio de fluorescência.
Materials
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
Referências
- Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).
- Payne, J. R., et al. Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).
- Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012. Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review. Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Li, R., Tablin, F. A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis. Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).
- Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).
- Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis. Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).
- Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).
- Li, B., et al. Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).
- Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).
- Qi, H., Yang, S., Zhang, L. Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis. Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).
- Laridan, E., et al. Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi. Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).
- Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy. BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation. Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).
- Rait, V. K., Xu, L., O’Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).
- Willingham, M. C. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).
- Davis, A. S., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).
- Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method. Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).
- Ducroux, C., et al. Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
