Medição do receptor complemento eririotcyte 1 usando citometria de fluxo
Summary
O objetivo deste método é determinar a densidade cr1 nos eritrócitos de qualquer sujeito, comparando-se com três sujeitos cuja densidade eritrócito CR1 é conhecida. O método utiliza citometria de fluxo após a imunocoloração dos eritrócitos dos sujeitos por um anticorpo monoclonal anti-CR1 acoplado a um sistema amplificado usando ficoitrina (PE).
Abstract
CR1 (CD35, Receptor Complementar tipo 1 para C3b/C4b) é uma glicoproteína de membrana de alto peso molecular de cerca de 200 kDa que controla a ativação complementar, transporta complexos imunológicos e participa de respostas imunes humorais e celulares. CR1 está presente na superfície de muitos tipos de células, incluindo eritrócitos, e exibe polimorfismos em comprimento, estrutura (Knops, ou KN, grupo sanguíneo) e densidade. A densidade média de CR1 por eritrócito (CR1/E) é de 500 moléculas por eritrócito. Essa densidade varia de um indivíduo para outro (100-1.200 CR1/E) e de um eritrócito para outro no mesmo indivíduo. Apresentamos aqui um método robusto de citometria de fluxo para medir a densidade de CR1/E, inclusive em sujeitos que expressam baixa densidade, com a ajuda de um sistema de imunocoloração amplificador. Este método nos permitiu mostrar a redução da expressão eritrócito cr1 em doenças como a doença de Alzheimer (DA), lúpus eritematoso sistêmico (LE), AIDS ou malária.
Introduction
CR1 (receptor complementar tipo 1, CD35) é uma glicoproteína transmembrana de 200 kDa presente na superfície de muitos tipos de células, tais como eritrócitos1, Linfócitos B2,células monocíticas, algumas células T, células dendríticas foliculares3, ostrócitos fetais4, e podocitos glomerulares5. CR1 interferindo com seus ligantes C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, uma subunidade do primeiro componente complementar, C1q10 e MBL (lectina de ligação manan)11 inibe a ativação do complemento e está envolvido na resposta imune humoral e celular.
Em primatas, incluindo humanos, o eritrócito CR1 está envolvido no transporte de complexos imunológicos para o fígado e baço, para purificar o sangue e prevenir seu acúmulo em tecidos vulneráveis como a pele ou rins12,13,14. Este fenômeno de adesão imune entre complexos imunológicos e eritrócitos depende do número de moléculas cr115. Em humanos, a densidade média de CR1/E é de apenas 500 (ou seja, 500 moléculas de CR1 por eritrócito). Essa densidade varia de um indivíduo para outro (100-1.200 CR1/E) e de um eritrócito para outro no mesmo indivíduo. Alguns indivíduos de fenótipo “nulo” expressam menos de 20 CR1/E16.
A densidade de CR1/E é regulada por dois alelos autossômicos co-dominantes ligados a uma mutação de ponto no intron 27 da codificação genética para CR1*117,18. Esta mutação produz um local de restrição adicional para a enzima HindIII. Os fragmentos de restrição obtidos após a digestão com HindIII neste caso são de 7,4 kb para o alelo ligado a uma forte expressão de CR1 (H: alelo alto) e 6,9 kb para o alelo ligado à baixa expressão CR1 (L: alelo baixo). Este elo é encontrado em caucasianos e asiáticos, mas não em pessoas de ascendência africana19.
O nível de expressão do eritrócito CR1 também está correlacionado com a presença de mutações de nucleotídeos pontuais no exon 13 codificando SCR 10 (I643T) e na codificação exon 19 SCR16 (Q981H). É alta em homozigosos 643I/981Q e baixa em indivíduos homozigos os 643T/981H20. Assim, indivíduos “baixos” expressam cerca de 150 CR1/E, indivíduos “médios” expressam cerca de 500 CR1/E e indivíduos “altos” expressam cerca de 1.000 CR1/E.
Além desse polimorfismo de densidade eritrócito, CR1 é caracterizado por um polimorfismo de comprimento correspondente a quatro alotipos de tamanhos diferentes: CR1*1 (190 kDa), CR1*2 (220 kDa), CR1*3 (160 kDa) e CR1*4 (250 kDa)21 e um polimorfismo antigênico correspondente ao grupo sanguíneo KN22.
Apresentamos nosso método baseado na citometria de fluxo para determinar a densidade de CR1/E. Utilizando três sujeitos cuja densidade CR1/E é conhecida, expressando um nível de baixa densidade (180 CR1/E), um nível de densidade média (646 CR1/E) e um nível de alta densidade (966 CR1/E), é fácil medir a intensidade média de fluorescência (Fi) de seus eritrócitos ou glóbulos vermelhos (RBC), ou RBC MFI, após imunocoloração anti-CR1 usando um citometro de fluxo. Pode-se então traçar uma linha padrão representando o MFI em função da densidade CR1/E. Medindo o FI de sujeitos cuja densidade CR1/E não é conhecida e comparando-a a esta linha padrão, é possível determinar a densidade cr1/E dos indivíduos. Esta técnica tem sido utilizada há muitos anos em laboratório, e nos permitiu detectar uma redução na expressão do eritrócito CR1 em muitas patologias como lúpus eritematoso sistêmico (SLE)23, Síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS)24, malária25, e recentemente doença de Alzheimer (AD)26,27. O desenvolvimento de medicamentos voltados para CR1 para acoplamento com eritrócitos, como no caso de drogas antitrombóticas28 requer a avaliação da densidade cr1/E, e a disponibilidade de uma técnica robusta para quantificar CR1.
O protocolo apresentado funciona em singlicato. É adaptável para determinar a densidade de CR1/E em muitos indivíduos que utilizam 96 placas de poços disponíveis comercialmente específicas (ver Tabela de Materiais). Para isso, é fácil adaptar nosso método a qualquer placa de poço 96. Para cada amostra, uma suspensão celular de eritrócitos (0,5 x 106–1 x 106 eritrócitos) é distribuída por poço. Para cada poço, primeiro é adicionado o anticorpo anti-CR1 primário, depois a streptavidin PE, o anticorpo anti-streptavidin secundário, e novamente streptavidin PE, usando as mesmas diluições que as do nosso método, mas adaptando volumes e respeitando a proporcionalidade.
As amostras de sangue dos sujeitos da faixa e dos sujeitos a serem quantificados para CR1 devem ser colhidas ao mesmo tempo, armazenadas na geladeira a 4 °C e manuseadas a 4 °C (no gelo e/ou na geladeira).
Protocol
Representative Results
Discussion
Várias técnicas estão disponíveis para determinar a densidade do eritrócito CR1 (CR1/E). As primeiras técnicas utilizadas foram a aglutinação de glóbulos vermelhos por anticorpos anti-CR131 e a formação de rosetas na presença de eritrócitos revestidos com C3b32. Estas técnicas rudimentares foram rapidamente substituídas por métodos de imunocoloração usando anticorpos anti-CR1 radiorotulados1,33. Ta…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos os membros da URCACyt, plataforma técnica de citometria de fluxo, equipe do Departamento de Imunologia, e a equipe do Departamento de Medicina Interna e Geriatria, que contribuíram para otimizar e validar o protocolo. Este trabalho foi financiado pelo Reims University Hospitals (número de subvenção AOL11UF9156).
Materials
| 1000E Barrier Tip | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 2079E | sample pipetting |
| 1-100 µL Bevelled, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1120-1840 | sample pipetting |
| Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) | Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook | immunostaining | |
| Blouse | protection | ||
| Bovin serum albumin (7,5%) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 15260037 | cytometry |
| Centrifuge | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 11176917 | centrifugation |
| Clean Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340345 | cytometry |
| Comorack-96 | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 944060P | rack |
| Cytometer Setup & Tracking Beads Kit | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 655051 | cytometry |
| Formaldehyde solution 36.5 % | Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France | F8775-25ML | Fixation |
| 10 µL Graduated, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1121-3810 | sample pipetting |
| LSRFORTESSA Flow Cytometer | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 647788 | cytometry |
| Microman Capillary Pistons | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 067494 | sample pipetting |
| Micronic 1.40 mL round bottom tubes | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | MP32051 | mix |
| Micropipette Microman – type M25 – | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 066379 | sample pipetting |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10010031 | cytometry |
| Pipette PS 325 mm, 10 mL | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 391952 | sample pipetting |
| powder-free Nitrile Exam gloves | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA | 486802 | sample protection |
| Reference 2 pipette, 0,5-10 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 20-100 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 100-1000 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | sample pipetting |
| Rinse Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340346 | cytometry |
| Round bottom tube | Sarstedt, F-70150 Marnay, France | 55.1579 | cytometry |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
| streptavidin R-PE | Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France | AS-60669 | immunostaining |
| Tapered Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10203001 | mix |
| Vector anti streptavidin biotin | Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France | BA-0500 | immunostaining |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA | SI-0236 | mix |
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