דו ח זה מתאר הקרנה של דטרגנטים שונים להכנת GPCR החזותית, הרודופסין ומתחם המורכב שלו עם mini-Go. השיטות הביוכימי המאפיינים את איכות הקומפלקס בשלבים שונים במהלך הטיהור מומחש. פרוטוקול זה ניתן להכליל למערכות חלבון ממברנה אחרים עבור המחקרים העתידיים שלהם במבנה.
המפתח לקביעת מבני גביש של מכלולי חלבון ממברנה הוא איכות המדגם לפני התגבשות. בפרט, בחירת חומרי הניקוי היא קריטית, כי היא משפיעה על יציבות ומונוטוני של המתחם. לאחרונה קבענו את מבנה הגביש של מצב פעיל של העין הרודוסין משולב לחלבון G מהונדס, mini-Go, ב 3.1 Å פתרון. כאן, אנו מפרטים את ההליך למיטוב הכנתמורכבות הרודוסין-מיני-ג’י. מדינה אפלה הייתה מוכנה בחומרי ניקוי קלאסיים וneopentyl גליקול (NPG), ואחריו מבנה מורכב עם מיני-G מתחת לחשיפה לאור. היציבות של הרודופסין הוערך על ידי הספקטרוסקופיית אולטרה-סגולה (UV-VIS), העוקבת אחר החוקה לתוך הרודופסין של ליגסין רגיש לאור, 9-cis ברשתית. השימוש האוטומטי בגודל כרומטוגרפיה (SEC) שימש כדי לאפיין אתהמורכבות של הרודופסין ומתחם המידוסין-מיני-ג’י. SDS-פוליאקרילאמיד אלקטרופורזה (SDS-PAGE) אישר את היווצרות הקומפלקס על ידי זיהוי של 1:1 היחס הטוחנת בין הרודופסין ו-mini-Go לאחר להכתים את ג’ל עם coomassie כחול. לאחר אימות כל הנתונים האנליטיים הללו, הצלחנו לבטל את הניקוי המתאים ולהמשיך בתכשיר הניקוי הטוב ביותר להכנה והתגבשות בקנה מידה גדול. בעיה נוספת עלתה בטרוגניות של N-הגליסיזילציה. באופן הטרוליאני-ביטוי בהדופסין נצפה ב-SDS-PAGE כדי להיות בעלי שני אוכלוסיות שונות משנת N-גליסיתיים, שכנראה היו מעכבת את crystallogenesis. לכן נבדקו אנזימים שונים של דגליקוזילציה, ואנדוגליסידאז F1 (EndoF1) הפיקה את הרודופסין עם מינים בודדים של N-הגליסיציה. עם צינור אסטרטגי זה לאפיון איכות החלבון, הכנת מתחם הרודוסין-mini-Go היה מיטבי כדי לספק את מבנה הגביש. זה היה רק מבנה הגביש השלישי של מורכב GPCR – G חלבון. גישה זו יכולה גם להיות כללית עבור חלבונים ממברנה אחרים מתחמי שלהם כדי להקל על הכנה לדוגמה ונחישות מבנה.
קביעת מבנים גביש של חלבונים הממברנה והתסביכים שלהם תמיד היה מאתגר בשל קשיים בהשגת קריסטלים היטב משחק. בניגוד לחלבונים מסיסים, חלבונים ממברנות אינטגרליים מהווים גרעין הידרופובי המתפרס על קרום התא. כדי להסיר חלבונים ממברנה מקרום התא לתוך מאגר מימית, חומרי ניקוי יש להשתמש כדי ליצור מיכל אבקת חלבון, ובכך להחליף את השומנים סביב הליבה הידרופובי של חלבונים ממברנה. יציבות, פעילות ויושרה של חלבונים ממברנה תלויים ישירות על תכונות כימיות ומבניות של אבקת הניקוי1, ואת התכונות של ניקוי גם לקבוע את הגודל של micelle. מיכל ניקוי גדול עשוי להיסגר את משטחי ההידרופיפילית של חלבון ממברנה קטן, ובכך מניעת התגבשות בשל חוסר המגע הגבישי בעת שימוש בשיטת דיפוזיה אדים. מיכל אבקת כביסה קטן הוא יתרון עבור קריסטלוגרפיה, אבל שרשרת שקלים קצרים בדרך כלל ולכן להוביל לחוסר יציבות וצבירה של חלבון הממברנה. לכן, לפני התגבשות, הליך נוסף ניקוי ההקרנה היא הכרחית, בדרך כלל מיקוד ניקוי קצר שעדיין לשמור על יציבות החלבון.
G חלבון מצמידים קולטנים (GPCRs) הם חלבונים ממברנה אינטגרלי המכיל שבעה טרנסקרום a-helices. GPCRs קיים בשני מדינות עיקריות, או מדינה לא פעילה התייצב על ידי אגוניסטים הופכי או אנטוניסטים, או מדינה פעילה המאוגדת אגוניסט והתייצב על-ידי חלבון G, למרות שסביר להניח כי ריבוי מדינות קיימות בין שני הקיצוניויות האלה. קביעת מבנה של GPCRs בתחילה התמקדה מדינות לא פעיל הקשורים אגוניסטים הופכי ו האנטוניסטים בשל היציבות הגבוהה שלהם מאשר מדינות פעיל2. כאשר GPCRs מופעלים על גבי כריכת אגוניסט, הקולטנים הם דינמיים מאוד, וצורות שסוע מארעיות על פני הפנים cytoplasmic של קולטן עבור צימוד חלבון G. הוא חשב כי דינמיות זו היא הסיבה מדוע אגוניסט מאוגד GPCRs הם לעתים קרובות יותר יציבה מאשר מצב לא פעיל. לכן, זה הופך להיות חיוני על המסך עבור חומרי ניקוי המתאימים למצב הקונמובי של הקולטן תחת המחקר, כי סביר להניח כי הניקוי מתון יהיה צורך ללמוד מדינה פעילה בהשוואה למצב לא פעיל.
בדו ח זה, אנו משתמשים ב-gpcr החזותית, בשור הרודוסין3, והקומפלקס שלועם חלבון mini -G4,5 לניסויים בסינון חומרי ניקוי, המייצגים את המצב הלא-פעיל והמצב הפעיל, בהתאמה. הקרנת חומרי הניקוי התמקדה בחומרי הניקוי הקלאסיים ובדטרגנטים הneopentyl גליקול (NPG). בהקשר זה, כביסה קלאסית בנויה מקבוצה של ראש סוכר ושרשרת אלקלאני, בעוד שחומרי הניקוי מסוג npg מכילים שני חומרי ניקוי קלאסיים זהים אשר מותתים על-ידי פחמן מקווארי בממשק בין סוכרים ושרשראות האלאלאני6,7,8.
זרימת עבודה ניסיונית תוכננה החל מטיהור של הרודופסין בדטרגנטים שונים, ולאחריה היווצרותמורכבות הרודוסין-מיני-ג’י ומסתיימת באפיון הקומפלקס באמצעות מספר שיטות (איור 1). עבור המצב הלא פעיל של הרודוסין, החוקה של האור רגיש ליגו 9-cis ברשתית היה מפוקח על ידי אולטרה סגול-גלוי (UV-VIS) ספקטרוסקופיית. הספקטרום חושף את המצב הגופני של הרשתית והוא מעיד על סביבתו בכיס המחייב הרשתית של הרודופסין. כרומטוגרפיה של הוצאה לפועל (SEC) הועסק על מנת להעריך מונוטוני של הרודופסין מטוהרים, כמו גם היווצרות שלמתחם המידוסין-מיני-ג’י. כמו שניה מבדיל בין מולקולות חלבונים לפי גודלם וצורתם, אוכלוסיית חלבון מצטברת יכולה להיות מזוהה כאשר הם בתוך עוצמת הריק. כדי לאשר מבנה מורכב, שברים מ-SEC העריכו על ידי נתרן dodecyl סולפט-פוליאקרילמיד ג’ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) כדי לאשר את הנוכחות של שני הרודוסין ו-mini-Go.
גורם נוסף שצריך להיחשב הוא שינויים פוסט-טרנסלtional (PTM) על החלבונים הממברנה. Ptm כגון N-הגליקוציה הם נצפו לעתים קרובות על חלבונים ממברנה איקריוטית המיוצרים מערכות ביטוי של תאי חרקים. זן N-גליקוזילציה מוגבלת של הכליה האדם העובריים 293 (HEK293) תאים פותחה על ידי מחיקה של קידוד הגנים N-acetylglucosaminyltransferase I (GnTI), וכתוצאה מכך הומוגנית N-הגליקוזילציה על-ידי GlcNAc2Man5 באתר הקונצנזוס Asn-X-Ser/שלושה. למרות שניתן למנוע את N-הגליסילציה על-ידי שינוי שאריות חומצות אמינו באתר הקונצנזוס, זה עשוי גם לשנות את התפקוד של החלבון או את היעילות של קיפול. בשור הרודוסין, מוטציה של השאריות N-גליסיטיות Asn15 מוביל לקיפול שגוי ולהפחית הפעלה של חלבון G9,10. הרודוסין המשמשת בדו ח זה באה לידי ביטוי בקו ה-HEK 293 GnTI לקוי. עם זאת, SDS-PAGE הראה נוכחות של שני מינים של הרודופסין. טרוגניות זה יכול למנוע היווצרות גביש ולכן deglycosylation באמצעות פפטיד-N-גליסידאז F (PNGase F) ו אנדוגליסידאז F1 (אנדו F1) נבדק. המוצר הדגליסילי התאפיין בספקטרומטר מוצרים (LC-MS) ובעזרת ספקטרומטריה לזיהוי רמת הגליקוציה וההומוגניות שלה.
ההצלחה התגבשות חלבונים מסתמך בחריפות על דגימת חלבון, בעיקר חלבונים ממברנה ומכלולי שלהם בשל הסיבוך הנגרם על ידי חומרי ניקוי. דו ח זה ממחיש הקרנת ניקוי והערכה של איכות דגימה עבור GPCR – מיני-G-מערכות חלבון איתות. מגוון של שיטות שימשו רבות לחקר המאפיין הביוכימי של חלבונים ממברנות, למשל, שיטת התרמויציבות באמצעות צבעי פלורסנט16,17, כריכה מחייבת לזהות היווצרות מורכב על ידי מדידת השינוי בטריפטופן שידור התדר18 או העברת אנרגיה התהודה עם ביוחיישנים19. עם זאת, הסביבות הכימיות המשמשות בשיטות אלה שונה לגמרי מאלה להכנת מדגם התגבשות, חלבונים הם בריכוז הנמוך ביותר של 1000 עבור מדידה מבוססי-פלואורסצנטית, או חלבונים מוטבעים bilayers ליפיד או במצב כביסה קבוע אחד. בפרוטוקול זה, השיטות המשמשות גם מתוקננת בהכנה לדוגמה בקנה מידה גדול לפני התגבשות. לכן, את הפרמטרים אופטימיזציה ניתן להעביר בקלות להכנה התגבשות בקנה מידה ללא הקרנה גדולה יותר ואופטימיזציה.
המטרה של פרוטוקול זה היא לייעל את הכנת GPCR יציבה והומוגנית-mini-G חלבון מורכב עבור אדים התגבשות דיפוזיה וקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן. הפרוטוקול משלב סדרה של שיטות כדי להעריך בצורה איכותית את ההשפעה של חומרי ניקוי והדגליסיציה במהלך הכנתמתחם הרודוסין-מיני-ג’י. הרודוסין במצב לא פעיל ומדינה המופעלת באור מאוגד עם וללא התמרה בפפטיד הפכה להיות מטוהרים כאשר מטוהר בחומרי הניקוי של הדטרגנטים (C8G)20,21,22 ו C9G23,24. כאשרמתחם הרודוסין-מיני-ג’י מטוהר ב-C8G ו C9G לא התשואה קריסטלים (הנתונים אינם מוצגים), לאחר מכן בחנו מגוון רחב יותר של חומרי ניקוי אחרים באמצעות האסטרטגיה המתוארת (איור 1). על ידי לקיחת היתרון של רגישות האור של הרודוסין, אנחנו יכולים מאוד לעקוב אחר החוקה של הרשתית על אורכי גל אחר מ 280 ננומטר. ב-UV-VIS ספקטרוסקופיית ו-SEC, גילינו ברשתית ב או 380 ננומטר או 488 ננומטר. עם זאת, רוב החלבונים הממברנה אין כרומטופור כזה נוח לעקוב אחר הפונקציונליות במהלך הטיהור. אפשרויות אחרות יהיה ליצור ליגייט על-ידי הוספת כרומופור אור כרומרופאר או באמצעות רדיוligand-מחייב ומשמרת תרמית בחני25.
לרודוסין יש משקל מולקולרי של 40 kDa. בשל המסה של חומרי ניקוי זה נקשר, משקל מולקולרי לכאורה שלה על שניות הוא על 120 kDa. לכן אין מפתיע כי הכריכה של מיני-Go (24 kda) לא זוהה בקלות ב-SEC, כמו זה היה לחייב הבדלה של חלבונים עם המוני לכאורה של 120 kda ו 144 kda. לפיכך, השתמשו בניתוח של שברים של SEC על ידי SDS-PAGE כדי לאשר מדגם טוהר ומבנה מורכב. גם אם פרופילי SEC מציגים שינוי ברור בצורה מורכבת, עדיין מומלץ לבצע ניתוח של SDS-PAGE כדי לאשר את המבנה המורכב עם שותפי האיגוד הנכונים ולא מזהמים אחרים של חלבון מטוהרים.
הן הרודופסין והן מיני-ג’י היו מטוהרים בכמויות מיליגרם, שאפשרו להשתמש בזיהוי רגישות נמוך של התסביכים, כגון קליטת UV-VIS במהלך שניות וכתמים כחולים של sds-PAGE. כאשר דגימות מוגבלות, זיהוי רגיש יותר יש להשתמש, כגון מטהר LC מצויד גלאי פלואורסצנטית כדי לעקוב אחר אותות טריפטופן מן החלבון (280 ננומטר, 350 פליטת nm) ומכתים כסף עבור SDS-דף ג ‘ לים. גישה נוספת תהיה לנתיך חלבון פלורסנט, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) על חלבון הריבית, אשר גם לאפשר איתור גם במהלך ביטוי החלבון26 אבל זה צריך להיות מוסר לפני התגבשות.
חיוני להבטיח כי חלבון מטוהר הוא גם חופשי של טרוגניות הנובעים משתנה לפטין. במקרה שמתואר כאן, שתי האוכלוסיות של הרודופסין שנצפו על SDS-דף היו מאופיינים כשיש אחד או שניים N-גליקנים. שינוי משתנה של חלבון עלול למנוע את היווצרות הקריסטלים היטב, ולכן אנו מדיגלינו את הרודופסין. האנדוגליזידאז אנדו F1 היה האפקט השכיח ביותר בדיקה וטיפול הוביל למין בודד של קולטן בלתי-גליזיאני, בעוד PNGase F הסיר באופן חלקי את הגליקנים על הרודוסין והביא לתערובת של הרודופסין באופן מלא, או עם אחד N-גליקן נשאר. הרודופסין ללא הטיפול בדגליסיקלז התגבשו בהצלחה3,27,28, ו-N-גליקן על הAsn15 ברודופסין חשוב ליצור קשר קריסטל במקרים אלה. במקרה של הרודוסין – mini-G,יש צורך להסיר את N-גליקנים על ידי אנדו F1 להשיג גבישים. אין כלל מתוקננת להסרת חלבונים מאוחרים של ריבית לפני התגבשות, אבל הסרת של הטרודוגני לפטין צריך להיחשב כאשר חלבונים להיכשל להתגבש לאחר מבחנים התגבשות נרחבת.
הנתונים והמתודולוגיה המתוארים כאן הדריכו אותנו לבחור את ה-OGNG כתכשיר הניקוי המועדף ביותר לצורך התגבשות מורכבות האודוסין-מיני-ג’י, בשל גודלו הקטן ויכולתה לייצב את הקומפלקס. השתמשנו גם אנדו F1 כדי להבטיח את הרודוסין הטהורה היה מין הומוגנית. גבישים התקבלו לאחר מכן וקבענו את מבנה הגביש כדי ~ 3.1 Å4, שהיה רק מבנה הגביש השלישי של gpcr – מורכב בחלבון איתות14,29.
עבור חלבונים ממברנה מאוגד עם חלבון שותף, הם צריכים להיחשב שני חלבונים שונים. חלבון במדינות שונות תפקודית יש קונמציות שונות והוא ברמת אנרגיה שונה. לכן, מומלץ למטב את פרוטוקול ההכנה עבור כל מצב פונקציונלי כאשר הפרמטר עבור מצב לא פעיל אינו מועבר באופן מלא למצב המופעל. כמו כן, שלא לדבר על השינוי בתכונת החלבון המורכב על ידי קשירה של חלבון שותף. הפרוטוקול משתמש בשיטות הסטנדרטיות להכנת דגימת התגבשות כדי להכין חלבון ממברנה לא פעיל בדטרגנטים שונים, ואחריו הפעלת חלבונים והיווצרות מורכבות, ולאפיון איכות החלבון. כך, פרוטוקול זה יכול בקלות להיות כללית חלבונים ממברנה אחרים מתחמי שלהם למחקרים מבניים עם שינוי קטין.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לפרופסור ד ר גיהארד פ. שטלר לתמיכה ארוכת הטווח שלו בפרויקט זה, ד ר רוג’ר ג’יי. פי דוסון והופמן לה רוש לתמיכה בתרבות התאים. עבודה זו הייתה בחסות קרן המדע הלאומי השוויצרי (מענקים 210030_153145 ו310030B_173335 ל-GFXS), ומימון ל-CGT ממועצת המחקר האירופית (EMPSI, 339995) ומועצת המחקר הרפואי (MRC U105197215). FP מודה ETH ציריך באמצעות המרכז הלאומי של היכולת במחקר מולקולרי Ultrafast מדע וטכנולוגיה (NCCR חובה) ו-ETH המדע השני והטכנולוגי של הטכנולוגיה (ETH FAST). FP, JM, AB ו-CJT מכירים את התמיכה הפיננסית לטווח ארוך ממכון פאול שירר.
1D4 peptide | Peptide2.0 | Under request | |
9-cis retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
Autosampler A-900 | GE Healthcare | Discontinued | |
C9G | Anatrace | N324 | |
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor coctail | Roche | 5056489001 | |
Cymal-5 | Anatrace | C325 | |
Cymal-5NG | Anatrace | NG325 | |
Cymal-6 | Anatrace | C326 | |
Cymal-6NG | Anatrace | NG326 | |
DDM | Anatrace | D310 | |
DM | Anatrace | D322 | |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
Econo column | Bio-Rad | 7372512 | |
Ettan LC | GE Healthcare | Discontinued | |
FRAC-950 | GE Healthcare | Discontinued | |
HPLC Water 2795 Separation Module | Waters AG | 720000358EN | |
InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF) | Waters AG | – | |
LMNG | Anatrace | NG310 | |
Monitor UV-900 | GE Healthcare | 18110835 | |
Nanodrop 1000 | Witec AG/ThermoFisher | Discontinued | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 well | ThermoFisher | NP0323BOX | |
NuPAGE MES SDS buffer (20x) | ThermoFisher | NP0002 | |
OGNG | Anatrace | NG311 | |
PAGEr Minigel Chamber | Lonza | 59905 | |
Reprosil 200 C18-AQ column | Morvay Analytik GmbH | #s1503 | |
Superdex 200 Increase GL column | GE Healthcare | 28990944 | |
Tabletop centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
Ultracentrifuge Optima XE-100 | Beckmann Coulter | A94516 | |
ULTRA-TURRAX T25 | IKA WERKE | 0003725003 | |
UV-VIS spectrophotometer | Shimadzu | UV-2401PC | |
Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector | Waters AG | – |