Ce rapport décrit le dépistage de différents détergents pour la préparation du GPCR visuel, de la rhodopsine et de son complexe avec mini-Go. Des méthodes biochimiques caractérisant la qualité du complexe à différents stades de purification sont démontrées. Ce protocole peut être généralisé à d’autres complexes de protéines membranaires pour leurs futures études structurelles.
La clé pour déterminer les structures cristallines des complexes de protéines membranaires est la qualité de l’échantillon avant la cristallisation. En particulier, le choix du détergent est essentiel, car il affecte à la fois la stabilité et la monodispersion du complexe. Nous avons récemment déterminé la structure cristalline d’un état actif de rhodopsine bovine couplée à une protéine G conçue, mini-Go, à 3,1 résolution. Ici, nous détaillons la procédure d’optimisation de la préparation du complexe rhodopsin-mini-Go. La rhodopsine à l’état foncé a été préparée dans des détergents classiques et neopentyl glycol (NPG), suivis d’une formation complexe avec mini-Go sous exposition légère. La stabilité de la rhodopsine a été évaluée par spectroscopie ultraviolette visible (UV-VIS), qui surveille la reconstitution en rhodopsine du ligand sensible à la lumière, rétinaire de 9 cis. La chromatographie automatisée de taille-exclusion (SEC) a été employée pour caractériser la monodispersité de la rhodopsine et du complexe de rhodopsin-mini-Go. L’électrophoresis SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) a confirmé la formation du complexe en identifiant un rapport molaire de 1:1 entre la rhodopsine et le mini-Go après avoir taché le gel avec le bleu Coomassie. Après avoir recoupé toutes ces données analytiques, nous avons éliminé les détergents inappropriés et continué avec le meilleur détergent candidat pour la préparation et la cristallisation à grande échelle. Un problème supplémentaire est né de l’hétérogénéité de la N-glycosylation. La rhodopsine héterologement-exprimée a été observée sur SDS-PAGE pour avoir deux populations différentes de N-glycosylated, qui auraient probablement entravé la cristallogenèse. Par conséquent, différentes enzymes de deglycosylation ont été testées, et endoglycosidase F1 (EndoF1) a produit de la rhodopsine avec une seule espèce de N-glycosylation. Avec ce pipeline stratégique pour caractériser la qualité des protéines, la préparation du complexe rhodopsin-mini-Go a été optimisée pour fournir la structure cristalline. Ce n’était que la troisième structure cristalline d’un complexe de signalisation de protéines GPCR-G. Cette approche peut également être généralisée pour d’autres protéines membranaires et leurs complexes afin de faciliter la préparation de l’échantillon et la détermination de la structure.
La détermination des structures cristallines des protéines membranaires et de leurs complexes a toujours été difficile en raison des difficultés à obtenir des cristaux bien-diffracting. Contrairement aux protéines solubles, les protéines membranaires intégrales constituent un noyau hydrophobe qui s’étend sur la membrane cellulaire. Pour éliminer les protéines membranaires de la membrane cellulaire en tampon aqueux, les détergents doivent être utilisés pour former une micelle détergent-protéine, remplaçant ainsi les lipides autour du noyau hydrophobe des protéines membranaires. La stabilité, l’activité et l’intégrité des protéines membranaires dépendent directement des propriétés chimiques et structurelles du détergent1, et les propriétés du détergent déterminent également la taille de la micelle. Une grande micelle détergente peut occluder les surfaces hydrophiles d’une petite protéine membranaire, empêchant ainsi la cristallisation due au manque de contacts cristallins lors de l’utilisation de la méthode de diffusion de vapeur. Une petite micelle détergente est avantageuse pour la cristallographie, mais les détergents à chaîne courte sont généralement plus sévères et conduisent donc à la déstabilisation et à l’agrégation de la protéine membranaire. Par conséquent, avant la cristallisation, une procédure supplémentaire de dépistage des détergents est indispensable, ciblant généralement des détergents plus courts qui maintiennent encore la stabilité des protéines.
Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) sont des protéines membranaires intégrales contenant sept transmembrane a-helices. Les RPGC existent dans deux États principaux, soit un état inactif stabilisé par des agonistes inverses ou des antagonistes, soit un état actif lié à un agoniste et stabilisé par une protéine G, bien qu’il soit probable qu’il existe une multitude de sous-états entre ces deux extrêmes. La détermination de la structure des GPCRs s’est d’abord concentrée sur les États inactifs liés aux agonistes et aux antagonistes inverses en raison de leur stabilité plus élevée que les États actifs2. Lorsque les GPCR sont activés sur la liaison agoniste, les récepteurs sont très dynamiques, et une fissure se forme transitoirement sur le visage cytoplasmique du récepteur pour l’accouplement de protéine G. On pense que ce dynamisme est la raison pour laquelle les GPCR à destination agoniste sont souvent plus instables que l’état inactif. Par conséquent, il devient essentiel de détergents appropriés à l’état conformationnel du récepteur à l’étude, car il est probable que des détergents plus doux seront nécessaires pour étudier un état actif par rapport à un état inactif.
Dans ce rapport, nous utilisons le GPCR visuel, rhodopsine bovine3, et son complexe avec mini-Go protéine4,5 pour les expériences de dépistage de détergent, représentant l’état inactif et l’état actif, respectivement. Le dépistage des détergents s’est concentré sur les détergents classiques de maltoside et de glucoside et les détergents de nopentyl glycol (NPG). Dans ce contexte, un détergent classique est construit à partir d’un groupe de tête de sucre et d’une chaîne d’alcyl, tandis que les détergents de type NPG contiennent deux détergents classiques identiques qui sont fusionnés par un carbone quaternaire à l’interface entre les sucres et les chaînes d’alcyl6,7,8.
Un flux de travail expérimental a été conçu à partir de la purification de la rhodopsine dans différents détergents, suivi de la formation du complexe rhodopsin-mini-Go et se terminant par la caractérisation du complexe à l’aide de plusieurs méthodes(figure 1). Pour l’état inactif de rhodopsine, la reconstitution de la rétinale 9-cis sensible à la lumière a été surveillée par spectroscopie ultraviolette visible (UV-VIS). Le spectre révèle l’état physicochimique de la rétinienne et est indicatif de son environnement dans la poche rétinienne de liaison de rhodopsine. La chromatographie d’exclusion de taille (SEC) a été employée pour évaluer la monodispersité de la rhodopsine purifiée aussi bien que la formation du complexe de rhodopsin-mini-Go. Comme SEC différencie les molécules de protéines par leur taille et leur forme, la population de protéines agrégées peut être identifiée comme ils elute dans le volume vide. Pour confirmer la formation complexe, des fractions de SEC ont été évaluées par le gel de sulfate-polyacrylamide de sodium électrophoresis (SDS-PAGE) pour confirmer la présence de rhodopsine et de mini-Go.
Un autre facteur qui doit être pris en considération est les modifications post-traductionnelles (PTM) sur les protéines membranaires. PTM tels que N-glycosylation sont souvent observés sur les protéines de membrane eucaryote produites dans les systèmes d’expression des mammifères et des cellules d’insectes. Une souche limitée de N-glycosylation des cellules embryonnaires humaines de rein 293 (HEK293) a été développée par la suppression du gène codant N-acétylglucosaminyltransferase I (GnTI), ayant pour résultat la N-glycosylation homogène par GlcNAc2Man5 au site consensuel Asn-X-Ser/Thr. Bien que la N-glycosylation puisse être évitée en mutant un résidu d’acide aminé dans le site consensuel, cela peut également modifier la fonction de la protéine ou l’efficacité du pliage. Dans la rhodopsine bovine, la mutation des résidus N-glycosylated Asn15 conduit au pliage incorrect et à l’activation réduite de protéine de G9,10. Le rhodopsin utilisé dans ce rapport a été exprimé dans heK 293 GnTI-déficience lignée cellulaire. Cependant, SDS-PAGE a montré la présence de deux espèces de rhodopsine. Cette hétérogénéité pourrait empêcher la formation de cristaux et donc la deglycosylation à l’aide de peptide-N-glycosidase F (PNGase F) et endoglycosidase F1 (Endo F1) a été testée. Le produit déglycosylé a été caractérisé par SDS-PAGE et la spectrométrie de masse chromatographie liquide (LC-MS) pour identifier le niveau de glycosylation et son homogénéité.
Le succès de la cristallisation des protéines repose fortement sur l’échantillon de protéines, en particulier les protéines membranaires et leurs complexes en raison de la complication causée par les détergents. Ce rapport démontre le dépistage et l’évaluation des détergents de la qualité de l’échantillon pour les complexes de signalisation des protéines GPCR-mini-G. Une variété de méthodes ont été largement utilisées pour étudier la propriété biochimique des protéines membranaires, par exemple, l’analyse de thermostabilité à l’aide de colorants fluorescents16,17, l’essai de liaison pour détecter la formation complexe en mesurant le changement dans le signal de fluorescence de tryptophane18 ou le transfert d’énergie de résonance avec des biocapteurs19. Cependant, les environnements chimiques utilisés dans ces méthodes sont très différents de ceux pour la préparation d’un échantillon de cristallisation, soit les protéines sont à une concentration mille fois plus faible pour la mesure à base de fluorescence, ou les protéines sont incorporées dans les bilayers lipidiques ou dans une condition de détergent fixe. Dans ce protocole, les méthodes utilisées sont également normalisées dans la préparation d’échantillons à grande échelle avant la cristallisation. Par conséquent, les paramètres optimisés peuvent être facilement transférés pour la préparation à l’échelle de cristallisation sans autre dépistage et optimisation majeurs.
L’objectif de ce protocole est d’optimiser la préparation d’un complexe de protéines GPCR-mini-G stable et homogène pour la cristallisation de diffusion de vapeur et la détermination de la structure par cristallographie aux rayons X. Le protocole intègre un ensemble de méthodes pour évaluer qualitativement l’impact du détergent et de la deglycosylation lors de la préparation du complexe rhodopsin-mini-Go. Rhodopsine à l’état inactif et l’état activé par la lumière lié avec et sans le peptide de transducine a été cristallisé lorsqu’il est purifié dans les détergents octyl glucoside (C8G)20,21,22 et C9G23,24. Comme le complexe rhodopsin-mini-Go purifié dans C8G et C9G n’a pas produit de cristaux (données non montrées), nous avons ensuite exploré un plus large éventail d’autres détergents à l’aide de la stratégie décrite(figure 1). En profitant de la sensibilité lumineuse de la rhodopsine, nous pourrions très bien suivre la reconstitution de la rétinienne à longueurs d’onde autres que 280 nm. Dans la spectroscopie UV-VIS et la SEC, nous avons détecté la rétine à 380 nm ou 488 nm. Cependant, la plupart des protéines membranaires n’ont pas un chromophore si pratique pour suivre la fonctionnalité pendant la purification. D’autres options seraient de rendre un ligand détectable en ajoutant un chromophore détectable de lumière ou en utilisant radioligand-liaison et les essais de décalage thermique25.
Rhodopsin a un poids moléculaire de 40 kDa. En raison de la masse de détergent qu’il lie, son poids moléculaire apparent sur SEC est d’environ 120 kDa. Il n’est donc pas surprenant que la liaison de mini-Go (24 kDa) n’ait pas été facilement détectée sur SEC, car cela nécessiterait une différenciation des protéines avec des masses apparentes de 120 kDa et 144 kDa. L’analyse des fractions sec par SDS-PAGE a donc été utilisée pour confirmer la pureté de l’échantillon et la formation complexe. Même si les profils de la SEC montrent un changement clair sur la formation complexe, il est toujours recommandé d’effectuer une analyse SDS-PAGE pour confirmer la formation complexe avec des partenaires contraignants corrects plutôt que d’autres contaminants protéiques co-purifiés.
Les rhodopsins et les mini-Go ont été purifiés en quantités de milligrammes, ce qui a permis l’utilisation de la détection de faible sensibilité des complexes, tels que l’absorption UV-VIS pendant SEC et Commassie Coloring bleu des gels SDS-PAGE. Lorsque les échantillons sont limités, une détection plus sensible devrait être utilisée, comme un purificateur LC équipé d’un détecteur de fluorescence pour retracer les signaux de tryptophane provenant de la protéine (280 nm excitation, émission de 350 nm) et la teinture d’argent pour les gels SDS-PAGE. Une autre approche consisterait à fusionner une protéine fluorescente, comme la protéine de fluorescence verte (GFP) à la protéine d’intérêt, ce qui permettrait également la détection même pendant l’expression protéique26, mais elle devrait être enlevée avant la cristallisation.
Il est essentiel de s’assurer que la protéine purifiée est également exempte d’hétérogénéité résultant de MPT variables. Dans le cas décrit ici, les deux populations de rhodopsine observées sur les gels SDS-PAGE ont été caractérisées comme ayant un ou deux N-glycans. La modification variable d’une protéine pourrait potentiellement empêcher la formation de cristaux bien-diffracting, ainsi nous avons donc deglycosylated rhodopsin. L’endoglycosidase Endo F1 a été le plus d’effet endoglycosidase testé et le traitement a conduit à une seule espèce de récepteur nonglycosylated, tandis que PNGase F seulement partiellement enlevé les glycans sur la rhodopsine et a eu comme conséquence un mélange de rhodopsine complètement unglycosylated ou avec un N-glycan est resté. Rhodopsine sans traitement de deglycosylase a été cristallisé avec succès3,27,28, et le N-glycan sur rhodopsin Asn15 est important pour former le contact cristallin dans ces cas. Dans le cas de rhodopsin-mini-Go, il est nécessaire d’enlever les N-glycans par Endo F1 pour obtenir des cristaux. Il n’existe pas de règle normalisée pour déglycosyler les protéines d’intérêt avant la cristallisation, mais l’élimination des SMT hétérogènes devrait être envisagée lorsque les protéines ne se cristallisent pas après de vastes essais de cristallisation.
Les données et la méthodologie décrites ici nous ont guidés à choisir OGNG comme le détergent le plus préféré pour la cristallisation du complexe rhodopsin-mini-Go en raison de sa petite taille de micelle et de sa capacité à stabiliser le complexe. Nous avons également utilisé Endo F1 pour nous assurer que la rhodopsine purifiée était une espèce homogène. Les cristaux ont ensuite été obtenus et nous avons déterminé la structure cristalline à 3,14, qui n’était que la troisième structure cristalline d’un complexe de signalisation de protéines GPCR-G14,29.
Pour les protéines membranaires liées avec et sans protéine partenaire, elles doivent être considérées comme deux protéines différentes. Une protéine à différents états fonctionnels a des conformations différentes et est à un niveau d’énergie différent. Par conséquent, il est recommandé d’optimiser le protocole de préparation pour chaque état fonctionnel car le paramètre de l’état inactif peut ne pas être entièrement transférable à l’état activé. Aussi, sans parler du changement de la propriété protéique compliquée par la liaison d’une protéine partenaire. Le protocole utilise des méthodes qui sont normalisées pour la préparation d’un échantillon de cristallisation pour préparer les protéines membranes inactives dans différents détergents, suivies par l’activation des protéines et la formation complexe, et pour caractériser la qualité des protéines. Ainsi, ce protocole peut facilement être généralisé à d’autres protéines membranaires et à leurs complexes pour des études structurelles avec modification mineure.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le professeur Gebhard F. X. Schertler pour son soutien à long terme à ce projet, le Dr Roger J.P. Dawson et Hoffmann La Roche, pour son soutien à la culture cellulaire. Ce travail a été parrainé par la Fondation nationale suisse des sciences (subventions 210030-153145 et 310030B_173335 à GFXS), et le financement à la CGT du Conseil européen de recherches (EMPSI, 339995) et du Conseil de recherches médicales (MRC U105197215). FP reconnaît ETH Zurich par l’intermédiaire du National Center of Competence in Research Molecular Ultrafast Science and Technology (NCCR MUST) et des programmes ETH Femtosecond et Attosecond Science and Technology (ETH FAST). FP, JM, AB et CJT reconnaissent le soutien financier à long terme de l’Institut Paul Scherrer.
1D4 peptide | Peptide2.0 | Under request | |
9-cis retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
Autosampler A-900 | GE Healthcare | Discontinued | |
C9G | Anatrace | N324 | |
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor coctail | Roche | 5056489001 | |
Cymal-5 | Anatrace | C325 | |
Cymal-5NG | Anatrace | NG325 | |
Cymal-6 | Anatrace | C326 | |
Cymal-6NG | Anatrace | NG326 | |
DDM | Anatrace | D310 | |
DM | Anatrace | D322 | |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
Econo column | Bio-Rad | 7372512 | |
Ettan LC | GE Healthcare | Discontinued | |
FRAC-950 | GE Healthcare | Discontinued | |
HPLC Water 2795 Separation Module | Waters AG | 720000358EN | |
InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF) | Waters AG | – | |
LMNG | Anatrace | NG310 | |
Monitor UV-900 | GE Healthcare | 18110835 | |
Nanodrop 1000 | Witec AG/ThermoFisher | Discontinued | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 well | ThermoFisher | NP0323BOX | |
NuPAGE MES SDS buffer (20x) | ThermoFisher | NP0002 | |
OGNG | Anatrace | NG311 | |
PAGEr Minigel Chamber | Lonza | 59905 | |
Reprosil 200 C18-AQ column | Morvay Analytik GmbH | #s1503 | |
Superdex 200 Increase GL column | GE Healthcare | 28990944 | |
Tabletop centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
Ultracentrifuge Optima XE-100 | Beckmann Coulter | A94516 | |
ULTRA-TURRAX T25 | IKA WERKE | 0003725003 | |
UV-VIS spectrophotometer | Shimadzu | UV-2401PC | |
Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector | Waters AG | – |