Visualización de la resistencia bacteriana mediante sondas fluorescentes antibióticas

1. Síntesis de alquino-fluoróforos Síntesis de NBD-alkyne (7-nitro-N-(prop-2-yn-1-yl)benzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-amine) Disolver 1.031 mg de 4-cloro-7-nitro-benzofurano (5.181 mmol) en 60 ml de tetrahidrofurano (THF). Añadir 1,857 mg de CsCO3 (5.696 mmol), luego 0,39 ml de propargilamina (6,1 mmol). Calentar la reacción a 50 oC durante 2 h, que cambiará de marrón a verde, luego se enfría a temperatura ambiente (RT). Filtrar la reacción con una ayuda de filtrado (ver Tabla de Materiales)y lavar con acetato de etilo (EA). Concentrar el filtrado bajo presión reducida, luego disolver el residuo en 150 ml de EA y pasar a un embudo separador de 500 ml. Lave la solución de EA con 100 ml con agua y salmuera respectivamente. A continuación, combinar las fases acuosas y lavar 2x con 100 mL de EA. Secar las fases orgánicas combinadas sobre el sulfato de magnesio anhidro, luego filtrar y concentrar bajo presión reducida. Purificar el producto crudo mediante cromatografía flash en gel de sílice (20-30% EA en éter de petróleo [PE]), comprobando la pureza mediante espectrometría de masas de cromatografía líquida (LCMS, [M+H]+ 219.1) y/o espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), cambios químicos de la siguiente manera:1 H NMR (CD3OD, 600 MHz) a 8,54 (d, J a 8,7 Hz, 1H), 6,35 (d, J a 8,4 Hz, 1H), 4,31 (dd, J a 5,7 Hz, J a 2,5 Hz, 2H), 2,43 (t, J a 2,5 Hz, 1H); 13 NMR de C (CD3OD, 150 MHz) 144,3, 143,7, 142,2, 135,8, 125,7, 100,0, 76,5, 74,2, 33,4.NOTA: Al realizar la purificación mediante cromatografía de gel de sílice, prepare la columna utilizando el menos polar de los disolventes enumerados. El compuesto crudo puede cargarse como una solución concentrada o adsorbido en la sílice si la solubilidad no lo permite. Después de que el compuesto se ha añadido a la parte superior de la sílice, ejecutar a través de 1-2 volúmenes de columna del mismo disolvente utilizado para la humectación de sílice. A continuación, comience con la relación de disolvente enumerada, corriendo a través de al menos 1 volumen de columna de cada disolvente, y asegurándose de no hacer grandes saltos en la composición del disolvente. Recoger fracciones, y comprobar la pureza / identidad por LCMS o TLC (cromatografía de capa fina). Combine fracciones puras y concentre bajo presión reducida por evaporación rotativa. Síntesis de DMACA-alkyne (2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)acetamida).Disolver 5,02 g de 3-(dimetilamino)fenol (36,6 mmol) en 30 ml de etanol, luego añadir 6,7 ml de dietilo 1,3-acetonadilboxilato (36 mmol). Añadir 10,5 g de ZnCl2 (77,2 mmol), luego reflujo de la solución roja durante 42 h. Añadir 9,20 g adicionales de ZnCl2 (67,6 mmol), luego reflujo durante 8 h. Enfríe la reacción y concentre bajo presión reducida. Disperse el sólido rojo resultante en 200 ml de EA, filtre y, a continuación, transfiera a un embudo separador de 500 ml. Lave el EA con 200 ml cada uno de agua y salmuera, luego seque sobre sulfato de magnesio anhidro. Filtrar la fase orgánica seca y concentrar bajo presión reducida. Purificar el sólido rojo (etil 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)acetato) mediante cromatografía flash en gel de sílice (0–100% EA en PE), comprobación de pureza por LCMS ([M+H]+ 275.1) y/o RMN, cambios químicos de la siguiente manera:1 H NMR (CDCl3, 600 MHz) 7,30 (d, J a 8,9 Hz, 1H), 6,52 (dd, J a 8,9 Hz, J a 2,6 Hz, 1H), 6,40 (d, J a 2,6 Hz, 1H), 5,87 (m, 1H), 2,96 (m, 8H), 2,25 (d, J a 1,2 Hz, 3H). Disolver 488 mg de etil 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)acetato (1,18 mmol) en 10 ml de THF, luego añadir una solución de 157 mg de LiOH H2O (3,74 mmol) en 15 ml de agua. Revuelva la reacción a RT durante 3 h, luego pase a un embudo separador y diluya con 50 ml adicionales de agua. Lavar la mezcla de reacción 2x con 50 ml de éter dietílico (Et2O), luego lavar la fase orgánica combinada 2x con 25 ml de agua. Tome cualquier precipitado amarillo con la capa orgánica. Concentre la fase orgánica bajo presión reducida utilizando un evaporador rotativo. Acidificar la fase acuosa a pH 2 con HCl concentrado, y enfriar a 4 oC durante la noche. Filtrar la fase acuosa acidificada y añadir el sólido amarillo a la fase orgánica concentrada.NOTA: El ácido acético 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)se puede utilizar sin purificación adicional, pero esto puede ser comprobado por LCMS ([M+H]+ 247.1) y/o NMR, cambios químicos de la siguiente manera:1 H NMR (CDCl3, 600 MHz) 7,41 (d, J a 9,0 Hz, 1H), 6,62 (dd, J a 9,2 Hz, J a 2,8 Hz, 1H), 6,52 (d, J a 2,8 Hz, 1H), 5,98 (d, J a 0,9 Hz, 1H), 3,05 (s, 6H), 2,35 (d, J a 0,9 Hz, 2H); 13 C NMR (CDCl3, 150 MHz) 162,2, 155,7, 152,9, 152,8, 125,3, 109,7, 109,3, 109.1, 108.8, 98.3, 40.2, 18.5. Disolver 466 mg de 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)ácido acético (1,89 mmol) en 7 ml de nseco,N-dimetilformamida (DMF) y colocar bajo una atmósfera de nitrógeno. Disolver 0,33 ml de proargilamina (5,1 mmol) en 7 ml de DMF seco bajo nitrógeno. Añadir 1,30 ml de di-isopropilinil amina (DIPEA, 7,50 mmol) a la solución de tinte, luego 535 mg de O-(1H-6-clorobenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametiluroniumafluorofosfato (HCTU, 1.29 mmol). Revuelva la solución de tinte activada durante 15 minutos a RT, luego agregue la solución de amina en sentido de gota y deje que se revuelva durante la noche. Al día siguiente, diluir la reacción con 35 ml de agua y luego concentrarse bajo presión reducida. Particione el sólido naranja resultante entre EA y salmuera (100 ml cada uno) en un embudo separador de 250 ml. Separe las capas (ejecute las dos capas en diferentes matraces) y lave la fase acuosa con 100 ml de EA. Concentrar las fases orgánicas combinadas bajo presión reducida, luego volver a disolver el sólido naranja en 3 ml de 1:1 acetonitrilo (ACN)/agua (v/v). Purificar el producto crudo inyectándolo en un sistema de cromatografía líquida de presión media de fase inversa (MPLC) equipado con una columna de cartucho C18 (solvente A: agua, disolvente B: ACN). Compruebe la pureza de las fracciones por LCMS ([M+H]+ 284.1, cambios químicos de RMN que se indican a continuación), luego combine y liofilice las fracciones apropiadas para dar 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)acetamide, NMR cambios químicos de la siguiente manera:1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6) a 8,65 (t, J a 5,4 Hz, 1H), 7,52 (d, J a 9,0 Hz, 1H), 6,72 (dd, J a 9,1, 2,6 Hz, 1H), 6,55 (d, J a 2,6 Hz, 1H), 6,00 (s, 1H), 3,88–3,87 (m, 2H), 3,62 (s, 2H), 3,13 (t, J, 2,5 Hz, 1H), 3,01 (s, 6H); 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d6) 167,7, 160,7, 155,4, 152,9, 151,0, 126,0, 109,4, 109.1, 108.1, 97.5, 80.9, 73.3, 39.7, 38.4, 28.2. 2. Síntesis de antibióticos fluorescentes Preparar un derivado de azida de un antibiótico como se describió anteriormente14,15,16.NOTA: El procedimiento es específico de cada antibiótico y requiere un examen cuidadoso de la relación de actividad de la estructura (SAR) de la molécula padre para asegurarse de que el antibiótico funcionalizado conserva una actividad comparable a la del padre. (por ejemplo, ciprofloxacino16, linezolid14y trimetoprim15). Consulte la Figura 1 para ver ejemplos de antibióticos fluorescentes publicados y el esquema de síntesis general. Procedimiento de reacción de clic ANOTA: Para la mayoría de los antibióticos, siga el procedimiento detallado aquí para el huisgeno catalizado de cobre [2+3] cicloadición de azida (paso 2.1) y alquino fluorescente (preparado en el paso 1). Colocar el antibiótico de azida en un matraz de fondo redondo y añadir tert-butanol (tBuOH) y agua (1:1 v/v, 25 mL cada uno por mmol azide). Añadir el fluoróforo-alquino preparado en el paso 1.1 (3 eq.) y calentar la reacción a 50 oC. A continuación, añadir sulfato de cobre (100 mM en agua, 0,6 eq.) a la reacción, seguido de ácido ascórbico (500 mM en agua, 2,4 eq.). Revuelva la reacción a 50 oC durante 1 h, o hasta que el LCMS lo realice tras la indicación de la finalización de la reacción (consumo completo de azida inicial). Enfriar la reacción y purificar según corresponda para el andamio antibiótico y proceder a la purificación ya sea por el paso 2.3 o 2.4.NOTA: Son posibles varios métodos de purificación diferentes, dependiendo de la polaridad y estabilidad del andamio. Procedimiento de reacción de clic BNOTA: Siga este procedimiento para los antibióticos basados en péptidos, para proporcionar condiciones de reacción más fuertes (trabajo inédito, Phetsang, 2019). Coloque el péptido de azida-antibiótico en un matraz de fondo redondo y agregue suficiente DMF (750 ml/mmol de azida) para disolver. Añadir el fluoróforo-alquino preparado en el paso 1 (5 eq.) y calentar la reacción a 50 oC durante 1 h. Añadir cobre (I) yoduro (20 eq.), luego DIPEA (120 eq.), luego ácido acético (240 eq.). Remueva la reacción a 50 oC durante 1 h, o hasta que el análisis por LCMS indique la finalización de la reacción (es decir, el consumo completo de azida inicial). Enfriar la reacción y proceder a la purificación por el método 1 (ver paso 2.3). Método de purificación 1 (utilizado para ciprofloxacino, trimetoprim y linezolid) Inyecte la reacción de clic enfriada directamente en una columna de cartucho MPLC C18. Incorporar una fase de lavado largo (aproximadamente 10 min) al comienzo de la carrera (100% disolvente A), luego ejecutar un gradiente hasta 100% disolvente B, seguido de un retorno al disolvente A.NOTA: El disolvente A se puede elegir del agua, 0.05–0.1% ácido fórmico (FA) en agua, 0.05–0.1% ácido trifluoroacético (TFA) en agua, dependiendo de la solubilidad, estabilidad, y la mejor resolución de picos. El disolvente B se puede elegir entre acetonitrilo (ACN), 0,05–0,1% FA en ACN, 0,05–0,1% TFA en ACN, para que coincida con el disolvente A. Si la elución resulta difícil, el metanol se puede utilizar en lugar de ACN. Recoger y combinar fracciones apropiadas, como se indica por LCMS y color (masa correcta vista, pico singular), a continuación, liofilizar para dar el (semi)antibiótico fluorescente puro. Purificar aún más el producto si es necesario. Evaluar la pureza por RMN y/o LCMS y cromatografía líquida de alta presión (HPLC), utilizando una columna y un método apropiados para el andamio. Método de purificación 2NOTA: Si la solubilidad lo permite, la prepurificación puede ser llevada a cabo por el trabajo acuoso (utilizado para macrólidos, trabajo inédito, Piedra 2019). Diluir la reacción de clic enfriada con agua y Et2O (1:1 v/v, aproximadamente 10 veces la dilución del volumen de reacción inicial), transfiriendo a un embudo separador de tamaño adecuado. Separe las capas y lave la fase acuosa dos veces con Et2O. Lavar las fases orgánicas combinadas 2x con agua (igual volumen con fase orgánica), luego secar sobre Na2SO4. Filtrar la fase orgánica seca y concentrar bajo presión reducida. Purificar el producto crudo por MPLC y/o HPLC como se describe en el paso 2.4.4.NOTA: Consulte la Figura 2 para ver ejemplos de seguimientos LCMS de reacción de clic incompletos, completos y purificados. Los rendimientos purificados típicos para las reacciones de clic de antibióticos y fluoróforos oscilan entre el 30 y el 80 %.ADVERTENCIA: La mayoría de los productos químicos utilizados en estas síntesis poseen riesgos específicos para la seguridad. Se debe tener precaución en todo momento, incluido el uso de equipos de protección personal. Et2O, tBuOH, FA, ácido acético, PE, EA, THF, ACN, DMF, EtOH, DIPEA, propargilamina, y HCTU son todos inflamables; evitar el contacto con fuentes de calor o chispas. THF, propargilamina, DIPEA, tBuOH, FA, DMF, y PE son todos tóxicos; evitar la exposición. Propargilamina, CsCO3, ZnCl2, LiOH-H2O, DIPEA, CuI, FA, ácido acético, y HCl son todos corrosivos; evitar el contacto y estar al tanto del contacto con la superficie. ZnCl2, CuSO4, CuI, y PE presentan peligros ambientales; ser conscientes de las condiciones de eliminación. THF puede formar peróxidos explosivos; cuidar de las condiciones de almacenamiento. Las azidas orgánicas son explosivas; especialmente con la producción a gran escala. 3. Evaluación de la actividad antimicrobiana NOTA: Todos los trabajos relacionados con bacterias deben llevarse a cabo en condiciones estériles para evitar la contaminación del ensayo o del laboratorio. Todos los medios deben ser autoclavedos antes de su uso, y los materiales plásticos y equipos tales como pipetas deben mantenerse estériles. Se recomienda que el trabajo se realice en una campana de biocontención (tipo 2). Las reservas de glicerol de rayas de cepas bacterianas apropiadas para el andamio antibiótico sobre el agar caldo de lisógenia (LB, preparado según las instrucciones del fabricante), y crecen durante la noche a 37 oC.NOTA: La elección de las bacterias para probar la actividad antibacteriana debe hacerse sobre la base del andamio antibiótico que se utiliza. Se debe elegir una gama representativa de 5-10 bacterias de las especies que se sabe que son susceptibles al antibiótico, teniendo en cuenta las capacidades logísticas del laboratorio. Si es posible, también se deben probar bacterias resistentes. El protocolo que se indica a continuación funcionará en la mayoría de las bacterias, pero compruebe si se requieren condiciones especiales (por ejemplo, CO2,medios especiales) y realice modificaciones según sea necesario. Las bacterias que se ensayon con éxito utilizando estas condiciones incluyen Staphylococci, Streptococci, Bacilli, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, y Enterococcus faecium. Escoge una sola colonia de la placa, y el cultivo durante la noche en 5 ml de caldo Mueller-Hinton ajustado catiónico (CAMHB, preparado según las instrucciones del fabricante) a 37 oC. Diluir los cultivos nocturnos 40 veces en CAMHB y crecer hasta una fase de registro medio, densidad óptica a 600 nm (OD600) a 0,4–0,8, volumen 5 mL). Preparar las soluciones de stock de cada antibiótico fluorescente a 1,28 mg/ml en agua estéril, y pipetear 10 l de antibiótico a la primera columna de una placa de 96 pozos. Añadir 90 l de CAMHB a la primera columna y 50 l a todos los demás pozos. A continuación, realice una dilución en serie 2 veces a través de la placa. Mezclar a fondo, luego diluir los cultivos de fase de registro medio a 106 unidades formadoras de colonias (CFU) / ml y añadir 50 l a todos los pozos, para proporcionar una concentración final de 5 x 105 CFU / ml.volumen de cultivo (mL) (volumen de medios en ml)/(OD600 x 1.000)p. ej., para un cultivo de600 o00 o 0,5 oD en un volumen de medios deseado de 12 ml, añada (12/(0,5 x 1.000) a 0,024 ml de cultivo a 12 ml de medios Cubra las placas con tapas e incubar a 37 oC durante 18-24 h sin agitar. Inspeccione visualmente las placas, siendo el MIC el pozo de concentración más bajo sin crecimiento visible.NOTA: Consulte la Tabla 1 para ver algunos ejemplos de antibióticos fluorescentes activos e inactivos. 4. Análisis de la acumulación de sondas por espectrofotometría y citometría de flujo NOTA: Estos tiempos de centrifugación han sido optimizados para E. coli,por lo que pueden ser necesarias ligeras alteraciones para otras especies. Se informa de datos representativos para la acumulación de sondas para la sonda ciprofloxacino etiquetada por NBD. Las reservas de glicerol de rayas de las cepas bacterianas sobre el agar LB crecen durante la noche a 37 oC. Escoge una sola colonia de la placa y el cultivo durante la noche en LB a 37oC. Diluir los cultivos nocturnos 50 veces en los medios de comunicación y crecer hasta la fase de registro medio (OD600 a 0,4–0,8). Centrifugar las culturas a 1.470 x g durante 25 min y decantar los medios de comunicación. Resuspenda las bacterias en 1 ml de solución salina con fosfato (PBS), luego centrífuga a 1.470 x g durante 15 min. Decantar los medios y resuspender los pellets lavados en PBS a una OD final600 x 2. Si lo desea, añadir 10,1 ml de cianuro de carbonilo 3-clorofenilhidrazona (CCCP, 10 mM en PBS) a 1 ml de bacterias (concentración final 100 oM) e incubar a 37 oC durante 10 min.NOTA: El PCC es un inhibidor de la bomba de eflujo. La adición de PCCC permitirá examinar el impacto del eflujo. Centrifugar los cultivos a 18.000 x g durante 4 min a 20oC y decantar los medios. Añadir 1 ml de solución antibiótica fluorescente (10–100 m en PBS) al pellet, e incubar a 37 oC durante 30 min. Centrifugar los cultivos a 18.000 x g durante 7 min a 4oC y decantar los medios. Resuspenda las bacterias en 1 ml de PBS frío y repita el paso 4.9. Repita el paso 4.10 un total de 4x. Si se desea, las bacterias de la lia seglucen añadiendo 180 ml de tampón de lisis (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 y 2 mM de EDTA sódico) y, a continuación, 70 ml de lisozyma (72 mg/ml en H2O). Incubar a 37oC durante 30 min y, a continuación, congelar-descongelar 3x (78 oC durante 5 min, y luego 34oC durante 15 min). Sonicar las muestras durante 20 min, luego calentar a 65 oC durante 30 min. Centrifugar las muestras lysed (18.000 x g,8 min) y luego filtrar a través de una membrana de filtro de 10 kDa. Lavar el filtro el 4x con 100 s de agua. Transfiera el lisado a una placa de pozo negra 96 de fondo plano y mida la intensidad de la fluorescencia en un lector de placas con longitudes de onda de excitación y emisión apropiadas para el fluoróforo (es decir, DMACA:por ejemplo, 400 nm,a em a 490 nm; NBD:ex a 475 nm,a 545 nm.NOTA: Consulte la Figura 3 para ver ejemplos de análisis espectrofotométricos de bacterias utilizando el antibiótico fluorescente ciprofloxacino etiquetado con NBD. Para el análisis por citometría de flujo, se pueden utilizar las mismas condiciones de crecimiento y tinción (pasos 4.1–4.17), con cambios únicamente en la preparación final. Lleve el volumen total a 1 ml de PBS. Lea las muestras en un catómetro de flujo a un caudal de aproximadamente 60 l/min, utilizando la amplificación logarítmica para la adquisición de datos (excitación F1 a 488 nm; emisión a 525/20 nm). Registre un total de 10.000 eventos y, a continuación, analice los datos utilizando el software adecuado. Trazar la intensidad de la fluorescencia de F1 contra el número de recuentos de eventos, estimando la intensidad media de fluorescencia de los picos del histograma después de que la bacteria se manceló.NOTA: Consulte la Figura 4 para ver ejemplos de análisis de citometría de flujo de bacterias utilizando el antibiótico ciprofloxacina con etiqueta NBD. 5. Preparación para el análisis microscópico Cultivar subcultivos a OD600 a 0,4, en cuanto a la evaluación de MIC, luego dividir en alícuotas de 1 ml y centrífuga a 18.000 x g durante 3-5 min. Decantar y desechar los medios, luego resuspender el pellet bacteriano en 500 l de HBSS. Centrifugar a 18.000 x g durante 3 min, luego decantar y descartar medios. Preparar soluciones de sondas antibióticas en HBSS a concentraciones de 1–100 M. Resuspender las bacterias lavadas en 500 s de la solución de la sonda, e incubar a 37 oC durante 30 min. Repita el paso 5.3. Para un experimento de etiquetado múltiple, resuspenda el pellet en 500 ml de un tinte de ácido nucleico ortogonalmente coloreado. Para el verde, utilice Syto9 (5 m en HBSS); para el azul, utilice Hoechst 33342 (20 g/ml en HBSS). Incubar a RT durante 15-30 min. Repita el paso 5.3, luego resuspenda en 500 s de FM4-64FX (5 g/ml en HBSS) e incuba rinde a RT durante 5 min. Repita el paso 5.3, luego resuspenda en 500 sde HBSS y repita el paso 5.3 una vez más. Repita el paso 5.8 y, a continuación, suspenda finalmente las bacterias lavadas y tetoridas en 15 ml de medio de montaje (ver Tabla de Materiales). Soporte de montaje de pipeta en una diapositiva de microscopio y parte superior con un deslizamiento de cubierta de alto rendimiento, luego selle los bordes con esmalte de uñas transparente.NOTA: Consulte la Figura 5 para ver ejemplos de imágenes de microscopía confocal tomadas con ciprofloxacino con etiqueta NBD y antibióticos trimetoprim, y la Figura 6 para el antibiótico oxazolidinona (linezolid) con etiqueta DMACA.