Summary

Erstellen hochspezifischer chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme durch schrittweise Phage-Auswahl einer kombinatorischen Single-Domain-Antikörperbibliothek

Published: January 14, 2020
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Summary

Die Schaffung chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme mit gewünschter Affinität und Spezifität für einen bestimmten kleinen Molekülligand hätte viele biologische Sensor- und Betätigungsanwendungen. Hier beschreiben wir eine effiziente, verallgemeinerbare Methode zur de novo Engineering von chemisch induzierten Dimerisierungssystemen durch die schrittweise Auswahl einer phagenangezeigten kombinatorischen Ein-Domänen-Antikörperbibliothek.

Abstract

Protein-Dimerisierungsereignisse, die nur in Gegenwart eines kleinmolekularen Ligands auftreten, ermöglichen die Entwicklung von kleinmolekularen Biosensoren zur Zerlegung und Manipulation biologischer Bahnen. Derzeit gibt es nur eine begrenzte Anzahl chemisch induzierter Dimerisierungssysteme (CID) und neue Systeme mit gewünschter Empfindlichkeit und Selektivität für bestimmte kleinmolekulare Liganden zu erschaffen, bleibt eine Herausforderung im Bereich der Proteintechnik. Wir beschreiben hier ein Verfahren zum Screening mit hohem Durchsatz, kombinatorial binders-enabled sElection von CID (COMBINES-CID), für die de novo Engineering von CID-Systemen, die auf eine Vielzahl von Liganden anwendbar sind. Diese Methode verwendet die zweistufige Auswahl einer phagenangezeigten kombinatorischen Nanokörperbibliothek, um 1) “Ankerbinder” zu erhalten, die zuerst an einen Voninteresse gebundenen Liganden und dann an 2) “Dimerisierungsbinder” binden, die nur an Ankerbinder-Ligand-Komplexe binden. Zur Auswahl von Ankerbindern wird eine kombinatorische Bibliothek mit über 109 komplementär-bestimmenden Nanokörpern (CDR)-randomisierten Nanokörpern mit einem biotinylierten Liganden abgeschirmt und Treffer mit dem unbeschrifteten Liganden durch Bioschichtinterferometrie (BLI) validiert. Um Dimerisierungsbindemittel zu erhalten, wird die Nanokörperbibliothek mit Ankerbinder-Ligand-Komplexen als Ziel für positives Screening und den ungebundenen Ankerbindern für negatives Screening abgeschirmt. COMBINES-CID ist allgemein anwendbar auf ausgewählte CID-Bindemittel mit anderen Immunglobulin,Non-Immunoglobulin oder computerisch konstruierten Gerüsten, um Biosensoren für den In-vitro- und In-vivo-Nachweis von Medikamenten, Metaboliten, Signalmolekülen usw. zu erstellen.

Introduction

CID-Systeme, bei denen zwei Proteine nur in Gegenwart eines kleinmolekularen Liganden dimerisieren (Abbildung 1), bieten vielseitige Werkzeuge zum Sezieren und Manipulieren von Stoffwechsel-, Signal- und anderen biologischen Wegen1. Sie haben das Potenzial in der biologischen Betätigung, wie die medikamentöse T-Zell-Aktivierung2 und Apoptose3,4, zur Verbesserung der Sicherheit und Wirksamkeit der Adoptiv-T-Zelltherapie gezeigt. Darüber hinaus bieten sie eine neue Methodik für den In-vivo- oder In-vitro-Nachweis von Kleinmolekülzielen. Beispielsweise können CID-Proteine genetisch mit Fluoreszenzreportersystemen (z. B. Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET)5 und kreisförmig permutierten fluoreszierenden Proteinen)6 für Echtzeit-In-vivo-Messungen verschmolzen werden oder als Affinitätsreagenzien für Sandwich-Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA)-ähnliche Assays dienen.

Trotz ihrer breiten Anwendungen stellt die Schaffung neuer CID-Systeme, die von einem bestimmten kleinmolekularen Liganden gesteuert werden können, große Herausforderungen. Etablierte Proteinbinder-Engineering-Methoden einschließlich Tierimmunisierung7, In-vitro-Auswahl8,9und computergestütztes Proteindesign10 können Liganden-Bindungsproteine erzeugen, die über binäre Protein-Liganden-Wechselwirkungen funktionieren. Diese Methoden haben jedoch Schwierigkeiten, einen Liganden-induzierten ternären CID-Komplex zu schaffen. Einige Methoden erzeugen CID, indem sie zwei Liganden chemisch verbinden, die unabhängig voneinander an die gleichen oder unterschiedlichen Proteinebinden 11,12,13,14,15,16 oder sich auf die Auswahl von Bindemittelproteinen wie Antikörpern konzentrieren, die auf bereits bestehende kleine Molekül-Protein-Komplexe abzielen17,18, und somit eine begrenzte Auswahl an Liganden haben.

Wir haben vor kurzem eine combinatorial binders-enabled sWahl der CID (COMBINES-CID) Methode für de novo Engineering von CID-Systemenentwickelt 19. Diese Methode kann die hohe Spezifität der Liganden-induzierten Dimerisierung erhalten (z. B. eine Anker-Dimerisierungsbinder-Dissoziationskonstante, KD (ohne Ligand)/KD (mit Ligand) > 1.000). Die Dimerisierungsssspezifität wird mit Ankerbindern mit flexiblen Bindestellen erreicht, die konforme Veränderungen bei der Ligandenbindung mit sich bringen können, was eine Grundlage für die Auswahl von konform selektiven Bindemitteln bietet, die nur ligaandgebundene Ankerbinder erkennen. Wir demonstrierten einen Proof-of-Prinzip durch die Schaffung von Cannabidiol (CBD)-induzierten Heterodimeren von Nanokörpern, einem 12–15 kDa-Funktionsantikörperfragment aus Kamelid, das ein universelles Gerüst und drei flexible CDR-Schleifen (Abbildung 2)20enthält, die eine Bindungstasche mit anpassungsfähigen Größen für kleinmolekulare Epitope21,22bilden können. Insbesondere sollte die In-vitro-Auswahl einer kombinatorischen Proteinbibliothek kostengünstig und verallgemeinerbar für CID-Engineering sein, da die gleiche hochwertige Bibliothek auf verschiedene Liganden angewendet werden kann.

In diesem Protokoll und Video konzentrieren wir uns auf die Beschreibung der zweistufigen In-vitro-Auswahl und Validierung von Anker- (Abbildung 3A) und Dimerisierungsbindern (Abbildung 3B) durch Screening der kombinatorischen Nanokörperbibliothek mit einer Vielfalt von mehr als 109 unter Verwendung von CBD als Ziel, aber das Protokoll sollte auf andere Proteinbibliotheken oder Kleinmolekülziele anwendbar sein. Das Screening von CID-Bindemitteln dauert in der Regel 6 bis 10 Wochen (Abbildung 4).

Protocol

1. Bibliotheksbau Verwenden Sie eine synthetische kombinatorische Single-Domain-Antikörperbibliothek mit einer Vielfalt von 1,23–7,14 x 109, wie zuvor beschrieben19. Dieses Protokoll enthält zwar keine Bibliothekserstellung, kann aber auch auf andere kombinatorische Binderbibliotheken angewendet werden. 2. Biotinylierung von Ligandenziel oder Liganden Biotinylatieren Sie den ausgewählten Liganden, z.B. CBD und Tetrahydrocannabin…

Representative Results

Wir beschreiben die zweistufige In-vitro-Auswahl und Validierung von Anker- und Dimerisierungsbindern, indem wir die kombinatorische Nanokörperbibliothek mit einer Vielfalt von mehr als 109 unter Verwendung von CBD als Ziel screeningen. Die Beurteilung der Anreicherung der Phagenbiopanning während der aufeinanderfolgenden Selektionsrunden für Anker- und Dimerisierungsbindemittel ist wichtig. Typische Anreicherungsergebnisse nach 4:6 Auswahlrunden, wie in Abbildung 5 dargestellt…

Discussion

Es ist wichtig, die richtigen Konzentrationen von Eingangs-Phagenbibliotheken für verschiedene Runden der Biopanning zu wählen. Wir begannen in der Regel mit einer Eingabebibliothek von 1012–1013 Phagenpartikeln mit einer Diversität >109,so dass 100–1.000 Kopien jedes Phagenklons im Pull-Down-Test präsentiert werden konnten. Wenn die Phagenkonzentration in einem Bindungstest zu hoch oder zu niedrig ist, steigt die Wahrscheinlichkeit einer unspezifischen Bindung oder des Verlusts p…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch den University of Washington Innovation Award (an L.G.), ein Stipendium der U.S. National Institutes of Health (1R35GM128918 to L.G.) und einen Startup-Fonds der University of Washington (zu L.G.) unterstützt. H.J. wurde von einem Stipendium der Washington Research Foundation unterstützt. K.W. wurde von einem Stipendium des University of Washington Institute for Protein Design unterstützt.

Materials

1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution Thermo Fisher Scientific 34029
Agar Thermo Fisher Scientific BP1423-2
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) Millipore UFC900324
Ampicillin Thermo Fisher Scientific BP1760-25
Bio-Rad Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000002
BirA biotin-protein ligase standard reaction kit Avidity BirA500
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Casein Sigma-Aldrich C7078-1KG
CM13 Helper phage Antibody Design Labs PH020L
D-(+)-Glucose monohydrate Alfa Aesar A11090
Dynabeads M-280 Streptavidin Thermo Fisher Scientific 11205D
DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D
EDTA Thermo Fisher Scientific BP120-1
Fast DNA Ladder New England Biolabs N3238S
FastDigest BglI Thermo Fisher Scientific FD0074
Glycerol Thermo Fisher Scientific BP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28989335
HiPrep 26/10 Desalting Column GE Healthcare 17508701
HisTrap-FF-1ml GE Healthcare 11000458
Imidazole Alfa Aesar 161-0718
IPTG Thermo Fisher Scientific 34060
Kanamycin Thermo Fisher Scientific BP906-5
M13 Major Coat Protein Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53004
NaCl Sigma-Aldrich S3014-500G
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000
Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates Thermo Fisher Scientific 260251
Nunc MaxiSorp Thermo Fisher Scientific 44-2404-21
Octet RED96 ForteBio N/A
pADL-23c Phagemid Vector Antibody Design Labs PD0111
PEG-6000 Sigma-Aldrich 81260-1KG
Platinum SuperFi DNA Polymerase Invitrogen 12351010
PureLink PCR Purification Kit Thermo Fisher Scientific K310001
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 27704
Recovery Medium Lucigen 80026-1
SpectraMax Plus 384 Molecular Devices N/A
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG
Super Streptavidin (SSA) Biosensors ForteBio 18-5057
Superdex 75 increase 10/300 GL Column GE Healthcare 28-9909-44
T4 DNA Ligase Thermo Fisher Scientific 15224-025
TG1 Electrocompetent Cells Lucigen 60502-1
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283-100mL
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Tryptone Thermo Fisher Scientific BP9726-5
Tween 20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Yeast Extract Thermo Fisher Scientific BP1422-2
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89882

Referências

  1. Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. Chemically induced proximity in biology and medicine. Science. 359 (6380), (2018).
  2. Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), (2015).
  3. Straathof, K. C., et al. An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy. Blood. 105 (11), 4247-4254 (2005).
  4. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. The New England Journal of Medicine. 365 (18), 1673-1683 (2011).
  5. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  6. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).
  7. Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin. Journal of Immunology. 129 (3), 1165-1172 (1982).
  8. Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nature Biotechnology. 29 (3), 245-254 (2011).
  9. Chen, G., et al. Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS). Nature. Biotechnology. 19 (6), 537-542 (2001).
  10. Tinberg, C. E., et al. Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity. Nature. 501 (7466), 212-216 (2013).
  11. Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Controlling signal transduction with synthetic ligands. Science. 262 (5136), 1019-1024 (1993).
  12. Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation. Nature. 382 (6594), 822-826 (1996).
  13. Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4604-4607 (1996).
  14. Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
  15. Erhart, D., et al. Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers. Chemistry & Biology. 20 (4), 549-557 (2013).
  16. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 17 (5), 5475 (2014).
  17. Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications. Nature Chemical Biology. 14 (2), 112-117 (2018).
  18. Foight, G. W., et al. Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses. Nature Biotechnology. 37 (10), 1209-1216 (2019).
  19. Kang, S., et al. COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems. Journal of the American Chemical Society. 141 (28), 10948-10952 (2019).
  20. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  21. Fanning, S. W., Horn, J. R. An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop. Protein Science. 20 (7), 1196-1207 (2011).
  22. Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies. Journal of Molecular Biology. 430 (21), 4369-4386 (2018).
  23. Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. . The Single-Stranded DNA Phages. , 605-625 (1978).
  24. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5600-5607 (1994).
  25. Gu, L., et al. Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins. Nature. 515 (7528), 554-557 (2014).

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Gomez-Castillo, L., Watanabe, K., Jiang, H., Kang, S., Gu, L. Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library. J. Vis. Exp. (155), e60738, doi:10.3791/60738 (2020).

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