Os sistemas CID, nos quais duas proteínas se dinamizarapenas na presença de um ligand de molécula pequena (Figura 1),oferecem ferramentas versáteis para dissecar e manipular vias metabólicas, sinalização e outras vias biológicas^1. Eles demonstraram o potencial na atuação biológica, como a ativação de células T controladas por drogas² e a apoptose^3,4,para melhorar a segurança e eficácia da terapia de células T adotivas. Além disso, eles fornecem uma nova metodologia para a detecção in vivo ou in vitro de alvos de pequenas moléculas. Por exemplo, as proteínas CID podem ser geneticamente fundidas com sistemas de repórter de fluorescência (por exemplo, transferência de energia de ressonância fluorescência (FRET)⁵ e proteínas fluorescentes permutadas circularmente)⁶ para medições in vivo em tempo real, ou servir como reagentes de afinidade para ensaios imunosordobrados ligados a enzimas sanduíches (ELISA).

Apesar de suas amplas aplicações, a criação de novos sistemas CID que podem ser controlados por um dado ligand de pequenas moléculas tem grandes desafios. Métodos estabelecidos de engenharia de pasta de proteínas, incluindo imunização animal^7,seleção in vitro^8,9,e design computacional de^proteína10 podem gerar proteínas de ligação que funcionam através de interações binárias de proteína-ligand. No entanto, esses métodos têm dificuldades em criar um complexo cid ternary induzido por ligand. Alguns métodos criam CID ligando quimicamente dois ligantes que se ligam independentemente às mesmas ou diferentes proteínas^{11,12,13,14,15,16} ou dependem da seleção de proteínas de pasta, como anticorpos que visam complexos pré-existentes de pequenas moléculas e proteínas^17,18,e, portanto, têm uma escolha limitada de ligantes.

Recentemente desenvolvemos um método de bin dersbin ders-e nabled de CID (COMBINES-CID) método para engenharia de novo de sistemas CID¹⁹. Este método pode obter a alta especificidade da dimerização induzida por ligand (por exemplo, uma constante de dissociação da pasta de escorização âncora, K_D (sem ligand)/K_D (com ligand) > 1.000). A especificidade da imersão é alcançada usando pastas de âncora com locais de ligação flexíveis que podem introduzir mudanças conformais sobre a ligação, fornecendo uma base para a seleção de pastas conformaçãoseletivas que reconhecem apenas pastas de âncora ligadas. Demonstramos uma prova de princípio criando heterodimers induzidos por canabidiol (CBD) de nanobodies, um fragmento de anticorpo funcional de 12-15 kDa de camelid compreendendo um andaime universal e três loops cdr flexíveis (Figura 2)²⁰, que podem formar um bolso de ligação com tamanhos adaptáveis para epitopes de pequenas moléculas^21,22. Notavelmente, a seleção in vitro de uma biblioteca de proteína combinatória deve ser rentável e generalizável para a engenharia CID porque a mesma biblioteca de alta qualidade pode ser aplicada a diferentes ligantes.

Neste protocolo e vídeo, nos concentramos em descrever a seleção de duas etapas in vitro e validação de âncora(Figura 3A)e pastas de imersão(Figura 3B),selecionando a biblioteca nanobody combinatória com uma diversidade superior a 10⁹ usando CBD como alvo, mas o protocolo deve ser aplicável a outras bibliotecas de proteínas ou alvos de pequenas moléculas. A triagem de pastas CID geralmente leva 6-10 semanas(Figura 4).