タンパク質相互作用ネットワークのインプランタ同定のためのTurboIDベースの近接標識
Summary
ここで説明する近接標識法は、ニコチアナベンタミアナ葉組織におけるNLR免疫受容体のTIRドメインの相互作用パートナーの同定のための方法である。また、ニコティアナおよび他の植物種におけるこの技術を用いて、関心のある他のタンパク質間の相互作用を同定するための詳細なプロトコルも提供される。
Abstract
哺乳類細胞におけるタンパク質相互作用(PPI)の同定に、設計されたアスコルビンペルオキシダーゼ(APEX)または大腸菌ビオチンリガーゼBirA(BioID)を用いた近接標識(PL)技術が用いられています。しかし、APEXベースPLにおける有毒過酸化水素2(H2O2)、ビオチンによるインキュベーション時間(16~24時間)、およびBioIDベースPLの高インキュベーション温度(37°C)の要件は、植物への適用を厳しく制限しています。2最近説明した TurboID ベースの PL は、BioID と APEX の多くの制限に対応しています。TurboIDは室温(RT)条件の下でわずか10分の蛋白質の急速な近接標識を可能にする。TurboIDの有用性は動物モデルで実証されていますが、最近では、TurboIDベースのPLが、関心のあるタンパク質に近いタンパク質の標識に対するBioIDと比較して、植物において優れたパフォーマンスを発揮することを示しました。ここで提供される、ヌクレオチド結合性ロイシンリッチリピート(NLR)タンパク質ファミリーのN末端トール/インターロイキン-1受容体(TIR)ドメインをモデルとして用いたタンパク質相互作用パートナーの同定のためのステップバイステッププロトコルが提供される。この方法は、ベクター構築、タンパク質発現構築物のアグロインフィルトレーション、ビオチン処理、タンパク質抽出および脱塩、定量、およびアフィニティー精製によるビオチン化タンパク質の濃縮について説明する。ここで説明するプロトコルは、ニコチアナおよび他の植物種に関心のある他のタンパク質を研究するために容易に適応することができる。
Introduction
PPI は、さまざまな細胞プロセスの基礎です。PPIを同定するための伝統的な方法は、質量分析(IP-MS)1と結合した酵母ツーハイブリッド(Y2H)スクリーニングおよび免疫沈降法を含む。しかし、両方ともいくつかの欠点に苦しんでいます。例えば、Y2Hスクリーニングは、対象の植物または動物種のY2Hライブラリーの利用可能性を必要とする。これらのライブラリの建設は、労働集約的で高価です。さらに、Y2Hアプローチは、酵母の異種単細胞真核生物において行われ、これはより高い真核細胞の細胞状態を表さない可能性がある。
これに対し、IP-MSは、一過性または弱いPPIの捕捉効率が低く、また、存在量が少ないか疎水性の高いタンパク質には適していません。受容体様キナーゼ(RLKs)やNLRファミリーの免疫受容体などの植物シグナル伝達経路に関与する多くの重要なタンパク質は、低レベルで発現し、しばしば他のタンパク質と一過性に相互作用する。したがって、これらのタンパク質の調節の根底にあるメカニズムの理解を大幅に制限します。
近年、工学的アスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APEX)と変異型エシェリヒア・コリビオチンリガーゼBirAR118G(BioIDとして知られる)に基づく近接標識(PL)法が開発され、PPI2,3,43,4の2研究に利用されている。PLの原理は、目的の標的タンパク質が酵素と融合し、不安定なビオチンAMP(バイオAMP)の形成を触媒することです。これらの遊離バイオAMPは、PL酵素によって放出され、標的タンパク質の近傍に拡散し、10nm5の推定半径内の一次アミンにおける近位タンパク質のビオチン化を可能にする5。
このアプローチは、一時的な PPI や弱い PPI をキャプチャする機能など、従来の Y2H および IP-MS アプローチに対して大きな利点があります。さらに、PLは、天然の細胞環境における標的タンパク質の近位タンパク質の標識を可能にする。PL酵素の違いは、異なるシステムに適用する場合に固有の欠点を持っています。例えば、APEX は BioID と比較して高いタグ付け動態を提供し、哺乳類のシステムで正常に適用されますが、このアプローチでは有毒過酸化水素 (H2O2)の要件は、植物の PL 研究には適していません。
一方、BioIDベースのPLは有毒なH2O2の使用2を回避しますが、標識速度が遅く(ビビチン化を完了するのに18〜24時間を要する)ため、一過性のPPIのキャプチャの効率が低下します。また、BioIDによる効率的なPLに必要な高インキュベーション温度(37°C)は、植物4などの一部の生物に外部ストレスを導入する。したがって、植物におけるBioIDベースのPLの限定的な展開(すなわち、米のプロトプラスト、シロイヌナズナ、およびN.ベンタミアナ)は6、7、8、97,8,と報告されている。6最近説明したTurboID酵素は、APEXおよびBioIDベースのPL.TurboIDの欠乏を克服し、RT10で10分以内にPLの達成を可能にする高い活性を示した。TurboIDベースのPLは、哺乳類の細胞、ハエ、およびワーム10に正常に適用されています。最近、我々と他の研究グループは独立して最適化し、独立してN.ベンタミアナ植物とシロイヌナズナ植物とトマト毛深い根11、12、13、1411,12,13を含む異なる植物システムでPPIを研究するためのターボIDベースのPLの使用を14拡張しました。比較分析は、BioID11,14,14と比較して、植物のPLに対してTurboIDの方が優れていることが示された。また、従来の方法を用いて相互作用パートナーを得ることが通常困難であるNLR免疫受容体11との多数の新しい相互作用を同定することによって、プランタにおけるTurboIDベースのPLの堅牢性を実証した。
本プロトコルは、N.ベンタミアナ植物におけるNLR免疫受容体のN末端TIRドメインの相互作用タンパク質の同定を記述することによって、プランタにおけるTurboIDベースのPLを示す。この方法は、N.ベンタミアナの関心のあるタンパク質に拡張することができます。さらに重要なことは、シロイヌナズナ、トマトなどの他の植物種のPPIを調査するための重要な参考文献です。
Protocol
Representative Results
Discussion
TurboIDビオチンリガーゼは、ビオイド10の酵母ディスプレイベースの指向進化によって生成される。それは他のPL酵素よりも多くの利点を有する。TurboIDは、最適な成長温度が約25°C10であるハエやワームを含む他のモデルシステムにPLを適用することができます。PLアプローチは動物システムで広く使用されてきましたが、植物への応用は限られています。こ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立トランスジェニック科学技術プログラム(2019ZX08010-003からY.Z.)、中国国立自然科学財団(31872637からY.Z.)、中央大学基礎研究基金(2019TC028からY.Z.)、NSF-IOS-1354444444444444444444444 NSF-IOS-1339185、およびNIH-GM132582-01からS.P.D.K.
Materials
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
Referências
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