荧光钙成像及其后续原位杂交，用于异种性前体特征

所有涉及动物的工作都按照威廉和玛丽学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的协议进行。 1. 动物护理和胚胎处理 通过给人类胆囊性腺激素（HCG）进行皮下注射，以600U的剂量为雌性，400U为雄性，诱导自然交配。 注射后，将至少一只雄性青蛙和一只雌性青蛙放在室温罐中过夜。产卵通常在 HCG 管理后 9-12 小时开始。 收集胚胎。用2%半胱氨酸（pH 8.0）轻轻洗涤2-4分钟。 在 0.1x Mark 的改性振铃器溶液 （MMR） 中冲洗胚胎 3 倍（100 mM NaCl，2 mM KCl，1 mM MgSO4， 2 mM CaCl2， 5 mM HEPES， pH 调整为 7.4×7.6）。 将胚胎转移到含有0.1x MMR和50 μg/mL的金霉素的100毫米玻璃培养皿中。每个板50-100个胚胎的密度是适当的。 在14°C~22°C孵育菜肴，让胚胎发育，直到达到所需的发育阶段。用塑料转移移液器定期去除未受精的细胞和坏死或异常发育的胚胎。注：为确保一致性，根据Nieuwkoop和Faber16定义的形态学标准进行发育分期。感兴趣的阶段会因实验焦点而异。例如，关键的神经发育地标与阶段 14（神经发育开始）、第 18 阶段（神经管闭合开始）和第 22 阶段（尾芽伸长开始）相关。 2. 胚胎解剖和样品制备 解决方案准备 准备 2 mM Ca2+溶液，包含 116 mM NaCl、0.67 mM KCl、2 mM CaCl2+2H 2O、1.31 mM MgSO4和 4.6 mM Tris。对于每100 mL溶液，加入1 mL的青霉素/链霉素（10，000 U/mL青霉素;10，000 μg/mL链霉素）。将 pH 调整到 7.8 并进行过滤消毒。 通过组合 116 mM NaCl、0.67 mM KCl、4.6 mM Tris 和 0.4 mM EDTA 来制备无钙和镁 （CMF） 溶液。将pHH调节至7.8和高压灭菌器进行灭菌。对于每100 mL溶液，加入1 mL的青霉素/链霉素（10，000 U/mL青霉素;10，000 μg/mL链霉素）。将 pH 调整到 7.8 并进行过滤消毒。 用于解剖和成像的板的制备 紫外线消毒两个35毫米塑料培养皿和一个35毫米细胞培养皿（见材料表）。 在层流罩中工作时，准备两个 50 mL 塑料锥形管，每个管材包含 10 mL 的 2 mM Ca2+溶液。 留在层流罩中工作，在一个 35 mm 塑料培养皿中加入 2 mM Ca2+溶液，将 2 mL 的 2 mM Ca2+溶液添加到一个 35 mm 细胞培养盘中，将 2 mL 的 CMF 溶液添加到一个 35 mm 塑料培养皿中。 在层流罩外，用 0.1x MMR 填充两个 100 mm 塑料培养皿和一个 35 mm 塑料培养皿，并加装温霉素 （50 μg/mL）。用70%乙醇填充60毫米塑料培养皿。 在解剖前，将0.01克胶原酶B加入含有Ca2+溶液的50 mL管之一。混合良好，并将溶液转移到新鲜的 60 mm 塑料培养皿中。 在解剖显微镜的帮助下，识别所需发育阶段的胚胎。使用无菌转移移液器将至少6个合适的胚胎转移到步骤2.2.4中制备的含有0.1x MMR+根霉素的100毫米板之一。这将作为保持板。 使用无菌转移移液器将一个胚胎移植到含有 0.1x MMR + 根霉素的第二个 100 mm 板。这将作为解剖板。 如果解剖足够老的胚胎移动（大约阶段 23 或以上），在解剖前将每个胚胎转移到含有 0.1% 3-氨基酸乙酯的培养皿中，用文他霉素 （50 μg/mL） 稀释 0.1x MMR。一旦胚胎被固定，将其移植回含有0.1x MMR的培养皿，并结合文他霉素（50微克/mL），继续解剖。 小心地去除胚胎周围的膜膜。这最容易通过使用一对钝钳稳定胚胎，同时使用一对细钳抓住膜。小心地用细钳拉，将玻璃膜剥开。 使用细钳分离胚胎的背和腹区域。这可以通过使用钳子沿着前后轴”捏”胚胎，将其切成两半来实现。使用无菌转移移液器，使用步骤 2.2.5 中制备的胶原酶溶液将背部分转移到 60 mm 板。丢弃腹腔部分。 允许背外植物在室温下在胶原酶溶液中孵育1⁄2分钟。轻轻地将其移回解剖板。 通过仔细去除外皮的假定神经组织中的所有残留内皮和中皮污染来完成解剖。对于阶段 22 或更岁以上的胚胎，神经管也应被移除和丢弃。注：如有必要，在解剖过程中，步骤2.2.4中制备的70%乙醇的碟子可用于清除或重新消毒钳子。 解剖完成后，轻轻地将外植转移到步骤 2.2.3 中准备的 35 mm Ca2+溶液板。 重复步骤 2.4-2.9，直到收集了四个外苗。 使用 P1000 微移液器将所有四个外植转移到含有 CMF 溶液的 35 mm 板中，注意避免外部与空气-水界面之间的任何接触。轻轻旋转盘子，使所有的外植聚集在盘子的中心。 在室温下孵育1小时，使外植分离。注： 为了帮助解脱，0.025%~0.01%胰蛋白酶可以添加到CMF溶液中。这可能是有效分离较旧胚胎（阶段22岁及以上）所必需的。 此时，至少两个适当分级的胚胎应留在保持板上。将这些胚胎转移到一个新鲜菜中，里面装满了0.1x MMR，其中含有步骤2.2.4中制备的文他霉素，并使它们能够不受干扰地与覆盖的菜一起与外栽菜相配。这些胚胎将作为兄弟姐妹的对照。 使用超胶将微规则盖玻片（参见材料表）连接到步骤 2.2.3 中准备的 35 mm 细胞培养皿的底部。注：在盖玻片边缘周围放置一小块超级胶水，然后用力按压细胞培养皿的底面。位置标记将在胶水接触网格的任何位置被遮盖，因此保持盖玻片的中央网格部分没有粘合剂非常重要。 外植1小时后，使用P100微液管将其转移到细胞培养皿。为了在盘子的网格部分上盘出尽可能多的电池，将移液器放在靠近盘子表面的浅角，将移液器尖端置于网格的角落，朝内，并牢固地将细胞悬架排出网格状的面板。理想情况下，细胞会稳定在一个密密化的簇中。 在室温下孵育1小时，使细胞粘附在板上。当这种孵育开始时，确定并记录兄弟姐妹控制胚胎的发育阶段。 将 5 μL 1 mM Fluo-4 AM（参见材料表）与 2 μL 的 10% 普鲁尼克 F-127 酸混合。注：Fluo-4 AM 对光敏感，应始终保存在防光管或铝箔覆盖管中。 孵育完成后，将样品盘移到暗室或其他受光线保护的位置。使用微移液器从盘边缘去除 100 μL 溶液。将此溶液添加到 Fluo-4 AM/Pluronic F-127 酸的等分中，上下移液以混合，并将全部体积返回到样品盘。轻轻旋转以混合。 用铝箔盖住板，在室温下孵育1小时。当这种孵育开始时，确定并记录兄弟姐妹控制胚胎的发育阶段。 在孵育结束时，使用剩余的锥形管 2 mM Ca2+以下列方式执行三次介质洗洗：1） 从培养皿中取出 1 mL 溶液，添加 3 mL 的新鲜溶液，2） 从培养皿中取出 3 mL 溶液，添加 3 mL 的新鲜溶液，3） 从培养皿中取出 3 mL 溶液，添加 3 mL 的新鲜溶液。 3. 钙成像 注：钙成像是使用倒置共聚焦显微镜（材料表）进行的。 将样品板放在显微镜台上，注意保护样品板免受环境光照射。固定板后，使用标记标记板的前点，以便在后续成像中找到相同的视野。 在显微镜下找到样品（先是 10 倍，然后是 20 倍放大率）并选择适当的视场进行成像。理想的视野是细胞密集，但密度不是如此密集，以至于细胞被凝结或难以单独区分。 调整显微镜对焦，使网格规则的封面滑动可见。封面上标记的数字用作特定网格轨迹的唯一标识符，可用于定位相同的视场以进行其他成像。如果最初选定的视场不与任何数字重叠，请重新调整，直到在帧中出现可识别的数字。 拍摄所选视场的明亮场图像，并聚焦网格规则的封面。 调整对焦设置，并在对焦单元格的情况下拍摄所选视场的明亮场图像。 在细胞层聚焦时，使用 488 nm 激光照亮样品。可以针对每个实验优化 HV 和偏移值，以确保在 FITC 通道上检测到荧光的动态范围。 对于两小时的映像，请修改映像配置以记录 901 帧，扫描时间为 3.93 秒，间隔为 8 秒。运行配置以获取映像。 成像完成后，从显微镜阶段取出板。从板中取出 1 mL 溶液，并将其替换为 1 mL 的 2x MEMFA（200 mM MOPS、2 mM EGTA 和 2 mM MgSO 4，7.4% 甲醛）。 在室温下孵育板2小时，或在4°C下孵育。当这种孵育开始时，确定并记录兄弟姐妹控制胚胎的发育阶段。 固定完成后，从板中取出所有溶液，并将其替换为 2 mL 的 1x PBS。将板储存在 4°C 下，以便进一步加工。 4. 基因表达分析：探针合成 如下所述，生成用于原位杂交的反义RNA探针。此外，为同一基因生成检测探针，用作阴性对照。 为了纯化含有探针模板序列的质粒DNA，用含有模板质粒的细菌甘油储存150 mL的LB汤。在37°C孵育，在一夜之间或直到文化浑浊。 使用您选择的方法从细菌培养中纯化质粒DNA。注：我们使用麦克纳里-纳格尔中皮制备试剂盒获得高产量的质粒DNA。 为了确认质粒包含预期的插入物，执行限制消化并分析胶质胶上的产品。未切割的质粒也可以在胶原体凝胶上进行分析，以检查基因组DNA污染。 要使模板DNA线性化，建立一个100μL限制反应，其中包含20μg质粒DNA、2μL适当限制性酶和1x适当缓冲液。在37°C孵育至少2小时。 通过执行苯酚/氯仿提取，然后提取氯仿提取，提取线性DNA。 用100%乙醇沉淀DNA。这可以通过在样品中加入两卷冷乙醇并在-80°C下孵育，直到其凝固（15-30分钟）快速完成。 使用冷冻离心机在12，000 x g/4 °C下旋转20分钟，以颗粒DNA。 去除上清液，用200 μL的70%乙醇清洗颗粒。在 12，000 x g/4 °C 下旋转 5 分钟。 去除上清液和风干颗粒约5分钟，在20 μL的1x TE中重新悬浮，并储存在4°C，直到进一步使用。 要合成和纯化反义RNA探针，请结合15 μL的10 mM rCTP、15 μL的10 mM rGTP、15 μL的10 mM rATP、9.75 μL的10 mM rUTP和5.25 μL的10mm dig-11 UTP（参见材料表）。 从步骤 4.2-4.10 设置包含 4 μg 线性模板 DNA 的 50 μL 体外转录反应， 步骤 4.11 的 15 μL rNTP 混合物，5x 转录缓冲液的 10 μL，0.1 M DTT 的 5 μL，0.5 μL 的RNA酶抑制剂 （20 U/μL），以及 1.5 μL 的相应 RNA 聚合酶（T3、T7 或 SP6）。在37°C下孵育1小时。 在反应中加入额外的1.5μLRNA聚合酶，并返回到37°C，再延长一小时。 在反应中加入1μL的RQ1脱氧核糖核酸酶，并在37°C孵育10分钟，降解DNA模板。 在样品中加入30 μL的7.5 M LiCl溶液。移液器在-20°C下混合和孵育至少1小时。 使用冷冻离心机，在14，000 x g/4°C下旋转样品25分钟。 去除上清液，用 500 μL 的 70% 乙醇冲洗颗粒。在 14，000 x g/4 °C 下旋转 5 分钟。 去除上清液和风干颗粒约5分钟，在20μL无核酸酶水中重新悬浮。 在 10 倍的探针液中，将样品稀释到混合化缓冲液中浓度为 10 纳克/μL（50% 形式酰胺）， 5x SSC（盐碱-柠子钠;750 mM NaCl，75 mM柠酸钠，pH 7.0），1mg/mL托鲁拉RNA，0.1%补间-20，1x登哈特溶液，0.1%CHAPS，10mM EDTA和100 μg/mL肝素）。储存在-20°C，直到进一步使用。 5. 基因表达分析：原位荧光杂交 注：所有冲液均应使用无菌、单独包装的转移移液器使用约 1 mL 溶液进行。拆卸或添加溶液时，移液器应放置在板的边缘，并应尽可能轻柔地进行清理，以确保细胞不会从板表面脱落和丢失。 从板中取出 1x PBS（从步骤 3.10 开始）。用新鲜的1x PBS更换，在室温下孵育5分钟。 将 25 mL 的 0.1 M 三乙醇胺 （pH 8.0） 与 62.5 μL 的醋酸氢化物结合。混合好。用此溶液清洗盘子 10 分钟。 用 1x SSC 清洗板 5 分钟。 用 0.02 M HCl 清洗板 10 分钟以渗透细胞。 用1x PBS洗2次，每次5分钟。 取出溶液并添加1 mL的混合缓冲液（50% 形式酰胺， 5x SSC （750 mM NaCl， 75 mM 柠子酸钠， pH 7.0）， 1 mg/mL 托鲁拉 RNA， 0.1% 补间-20， 1x 登哈特溶液， 0.1% CHAPS， 10 mM EDTA， 和 100 μg/mL 肝素） 到板.在60°C下孵育至少6小时。 去除杂交缓冲液，用750 μL的1xRNA探针溶液（稀释形成步骤4.19中生产的10倍库存）。感RNA探针可用作负控制。 在60°C下孵育8-14小时。 拆下探头并储存在 -20°C。注：1x 探头稀释可在丢弃前重复使用最多三次。 用 0.2x SSC 冲洗盘子。 在 60°C 下用新鲜的 0.2x SSC 清洗 1 小时。 将板移到室温中，并平衡 5 分钟。 用 0.2x SSC 清洗板 5 分钟。 用 1x PBT 清洗盘子 15 分钟。 用 2% H2O2在 1x PBT （0.1% Triton-x-100） 清洗板 1 小时。注：此解决方案对光敏感，因此每个实验都应新鲜，并不受光线遮挡。板块也应在孵化过程中遮挡光或被挫败。 用 1x TBST（150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、pH 7.5、0.1%补间-20）清洗板 15 分钟。 稀释阻滞试剂至2%的雄性酸缓冲液（100 mM雄酸，150 mM NaCl，pH 7.5）。在室温下，将这种混合物中的细胞块住至少1小时。 用在马累酸缓冲液中稀释1：1，000在2%阻断试剂中的抗二氧基-POD抗体取代阻断溶液。在4°C下孵育过夜。 用 1x TBST 冲洗板 3 倍。 用 2mL 的 1x TBST 洗涤 4 倍，每次洗涤至少 15 分钟，并连续摇动。 用 1x PBT 洗涤 2 次，每次至少 10 分钟，并连续摇动。 稀释 Cy3 结合的 tyramide 1：25 在 1x PBT 中。用 750 μL 稀释 5 分钟清洗板。注：此溶液对光非常敏感，在实验的剩余时间内，应保持板材的箔片或挡光，以避免信号变坏。 在此溶液中加入 2.5 μL 的 H2O2，并在室温下通过连续摇动孵育 40 分钟。 用 1x TBST 洗涤 4 次，每次至少 15 分钟，持续摇动。 用 1x PBT 冲洗。 在室温下以1x MEMFA（100mM MOPS、1 mM EGTA和1mM MgSO4在3.7%甲醛）中孵育1小时，修复细胞。 取出溶液，用 1x PBS 替换。将板材储存在4°C的箔容器中，直到进一步加工。 6. 成像细胞 注：成像是使用倒置共聚焦显微镜进行的。 将样品板放在显微镜台上，将步骤 3.1 中制作的标记与舞台前部对齐。 对图像进行聚焦，使网格衬里的覆盖唇可见，并使用步骤 3.4 中拍摄的网格图像作为参考，调整视野以匹配钙图像中捕获的视场（第 3 节）。 获取网格和单元格的亮场图像。 使用 595 nm TRITC 激光照亮样品。调整增益值，使用图像和负控制单元正确区分信号和背景，并获取静止图像。注：理想情况下，背景荧光水平基于与非定向感RNA探针并行处理的负控制板确定。增益设置进行调整，使该板显示为完全黑色（对应于背景水平），然后保持恒定的其他板从该实验批次成像。 7. 数据处理 注：数据处理是使用尼康元素软件执行的。 从步骤 3.7 打开 2 h 钙图像。通过选择二进制>污点检测>亮点来识别对应于每个单个单元格的像素。确保已选择 FITC 通道。 生成此图层后，彩色圆圈将显示在单个单元格上。调整单元格分布和大小参数，以便识别尽可能多的单元格并与唯一标识符相关联。 通过导航到”查看>分析控件>跟踪选项”来跟踪图像所有帧的单元格。将 5 帧设置为轨道之间的最大间隙，删除与小于 600 帧关联的对象，然后选择”缩小间隙”选项。选择”跟踪二进制文件”以将单元格跟踪应用于图像。 跟踪单元格后，手动删除与单个单元格不对应的任何对象（例如，单元格群）。然而，数据点不应排除在基于钙活性轨迹的形态的进一步分析之外。 在”图像”窗格中，选择”查看叠加>显示二进制对象 ID”。滚动到图像的末尾（帧 901），然后选择”编辑>创建视图快照（8 位 RGB）”>当前帧>确定。这将创建图像的最后一帧的快照，每个单元格的关联二进制 ID 都可见。保存此映像。 通过选择所有对象，然后导出数据导出到 Excel来导出时间序列数据。将输出另存为 CSV 文件。 打开 FISH 图像。使用 TRITC 通道而不是 FITC 通道，优化现场检测，如步骤 7.1_7.2 中一样。手动删除任何分配错误的二进制文件，然后选择自动测量结果>更新测量以计算每个像元的信号强度。通过重复步骤 7.5 和 7.6 导出映像快照和数据表。 创建一个电子表格，其中列 A 标记为FISH 二进制 ID，列 B 标记为钙二进制 ID。打开步骤 7.5 和 7.7 中导出的图像。对于 FISH 图像（步骤 7.7）中标识的每个对象，在列 A 中记录二进制 ID。然后，在钙图像（步骤 7.5）中找到相应的单元格，并在 B 列中记录该二进制 ID。注： 使用照片编辑程序（如 Adobe Photoshop 或 GIMP 图像编辑器）打开两个图像，使一个半透明图像，并将其叠加到其伙伴图像上，以便更轻松地识别和链接与每个单元格关联的两个二进制 ID，这非常有用。 对于每个已识别的细胞，整理（手动或使用脚本）其时间序列钙数据（与钙二进制 ID 关联并在步骤 7.6 中导出）及其基因表达数据（与 FISH 二进制 ID 关联，并在步骤 7.7 中导出）。注：下游数据处理和分析可能涉及将这些数据整理到单个数据表中，并应用一系列分析技术，包括尖峰计数、分形分析和马尔可万熵，使调查人员能够辨别钙活性17、18的新模式。