Aclaración e imagen de Candida albicans Biofilms
Summary
Para ver y cuantificar las características internas de las biopelículas de Candida albicans, preparamos especímenes fijos intactos que se clarifican mediante la coincidencia del índice de refracción. A continuación, la microscopía de seccionamiento óptico se puede utilizar para obtener datos de imagen tridimensionales a través del espesor completo de la biopelícula.
Abstract
El hongo microbiano Candida albicans puede experimentar un cambio de la colonización commensal a la virulencia que está fuertemente correlacionada con su capacidad para cambiar del crecimiento de la forma de levadura al crecimiento hiphal. Las células que inician este proceso se vuelven adherentes a las superficies, así como entre sí, con el desarrollo resultante de una colonia de biopelículas. Esto ocurre comúnmente no sólo en las superficies del tejido mucoso en las infecciones por hongos, sino también en implantes médicos como catéteres. Es bien sabido que las células de biopelícula son resistentes a los medicamentos antifúngicos, y que las células que se desprenden de la biopelícula pueden conducir a infecciones sistémicas peligrosas. Las biopelículas varían de muy translúcidas a opacas debido a la heterogeneidad refractiva. Por lo tanto, las biopelículas fúngicas son difíciles de estudiar mediante microscopía óptica. Para visualizar las características estructurales internas, celulares y subcelulares, aclaramos las biopelículas intactas fijas mediante el intercambio escalonado de disolventes hasta un punto de coincidencia óptima del índice de refracción. En el caso de las biopelículas de C. albicans, se logra una aclaración suficiente con salicilato de metilo (n a 1.537) para permitir la microscopía confocal desde el ápice hasta la base en biopelículas de 600 m con poca atenuación. En este protocolo de visualización delineamos la refractometría de contraste de fase, el crecimiento de biopelículas de laboratorio, la fijación, la tinción, el intercambio de disolventes, la configuración de la microscopía de fluorescencia confocal y los resultados representativos.
Introduction
Candida albicans es un hongo microbiano que es típicamente commensal en los seres humanos. Es de interés fundamental para los biólogos porque el organismo tiene múltiples morfologías. Por ejemplo, en respuesta a ciertas señales ambientales o estresores, las células en ciernes en forma de levadura cambiarán al crecimiento filamentoso como cadenas septantes de células altamente alargadas conocidas como hifas. La transición es importante como ejemplo de expresión fenotípica de un cambio entre un programa de expresión génica unicelular y multicelular. Del mismo modo, C. albicans es de interés biomédico porque el organismo es un patógeno oportunista bien conocido. Es responsable de infecciones por hongos mucosos como el zorzal (candidiasis oral), infecciones genitourinarias y una causa de infecciones invasivas o sistémicas peligrosas en pacientes inmunológicamente debilitados.
El potencial de virulencia de este organismo está estrechamente relacionado con sus múltiples morfotipos y otros aspectos de su versatilidad genética1,2,3,4. La extensión del tubo germinal, la primera etapa visible de la transición al crecimiento hiphal, se produce con suficiente rapidez para permitir que las células Binacanas engullidas salgan de los fagocitos y así escapar de una fase temprana de la respuesta inmune celular del huésped5. Además, la filamentación va precedida y acompañada de un gran aumento de la adherencia de célula a célula y célula a superficie que se debe a la expresión regulada de varias clases de proteínas de pared celular conocidas como adhesinas6,7,8,9. En una amplia variedad de condiciones, la combinación de adherencia y filamentación resulta en un cambio dramático del crecimiento plancónico, unicelular al crecimiento colonial asociado a la superficie que forma una biopelícula. C. biofilms albicans pueden desarrollarse en dispositivos médicos implantados comunes como catéteres venosos. Las infecciones diseminadas pueden resultar cuando tales biopelículas comienzan a brotar de las células de forma de levadura y arrojarlas a la sangre circulante. Múltiples estudios han demostrado que las células biopelículas son más resistentes a los medicamentos antifúngicos que las células planctónicas10,11, que pueden deberse en parte a la reducción del metabolismo12. Además, la alta adherencia general de una biopelícula puede proporcionar el anclaje necesario para el crecimiento invasivo eficiente de hifas en el tejido huésped1.
La aclaración óptica de las biopelículas de C. albicans mediante la coincidencia de índices refractivos ha tenido un impacto importante en nuestra capacidad para visualizar la estructura de esta comunidad microbiana y descubrir relaciones entre la expresión génica y el fenotipo. Las biopelículas cultivadas en el laboratorio en superficies de ensayo bajo medio de cultivo líquido durante 48 h aparecen como un recubrimiento blanquecino que es lo suficientemente denso y lo suficientemente grueso como para ser opaco(Figura 1). Por lo tanto, muchas características fenotípicas interesantes de la biopelícula se ocultan a la vista. Las biopelículas de 24 h de tipo silvestre cultivadas en YPD, RPMI-1640, o medio araña a un rango de 37 oC de hasta 300 m de espesor, con biopelículas de 48 h que a menudo alcanzan los 500 m. La opacidad se debe a la dispersión de la luz, que surge de la heterogeneidad refractiva: la pared celular del hongo es más refractiva que el medio circundante, y el citoplasma ligeramente más refractivo que la pared celular. La alta densidad óptica resultante de una biopelícula nativa oscurece todas las estructuras de más de 30 m de profundidad cuando se ve con un microscopio convencional o incluso un escáner confocal(Figura 2). Sin embargo, se puede lograr un gran grado de aclaración infiltrando biopelículas fijas con un líquido de alto índice de refracción que coincide aproximadamente con la refracción de los principales componentes celulares. Después de la clarificación, las imágenes a resolución submicrones se pueden llevar a cabo mediante microscopía confocal a través de todo el espesor de casi cualquier biopelícula C. albicans 13. En especímenes de tipo silvestre, es fácil ver que las biopelículas consisten en hifas largas enredadas, racimos de células de forma de levadura en ciernes o células pseudohyphal, espacios vacíos y cierta cantidad de matriz extracelular. Además, las biopelículas generalmente se estratifican, mostrando diferencias morfológicas espacialmente variables en el tipo de célula, la densidad celular y la presencia de células en ciernes o ramificadas. Muchas variaciones en una o más de estas características se han observado en biopelículas desarrolladas por cepas mutantes14,15. Además, las cepas de reporteromuestran diferencias espaciales in situ en la expresión génica16,9,13. El sorprendente grado de aclaración que se puede obtener con este enfoque relativamente simple y económico también permite ver que muchas biopelículas incluyen hifas apicales e hifas invasivas basales que se extienden a distancias milimétricas.
En este protocolo de visualización, demostramos la fijación, etiquetado, aclaración e imagen de un biofilm de C. albicans utilizando un simple marcador de pared celular como mancha. El origen de la presente versión del protocolo es la claridad mejorada que observamos cuando las biopelículas fijas con formaldehído fueron infiltradas con metacrilato de glicol (GMA) al 97%, que luego fue polimerizado para incrustar la biopelícula en un plástico duro con un índice de refracción moderadamente alto (n.o 1,49). A continuación, utilizamos la microscopía de contraste de fase convencional y una serie de líquidos de referencia de índice de refracción para determinar con mayor precisión el punto de inversión de contraste (transparencia máxima) del biofilm(Figura 3). En el número de biopelículas de C. albicans, esto se produjo cerca de n x 1.530, lo que fue sorprendentemente alto dado que una estructura proteica densa como la queratina capilar es sólo ligeramente más refractiva (1,54–1,55). Aunque se encuentra en el extremo superior del rango óptimo en la Figura 3,adoptamos el salicilato de metilo (aceite de verde invernal, n a 1.537) en el protocolo actual porque durante mucho tiempo se ha utilizado como agente clarificador para la microscopía en embriología e histología, tiene baja toxicidad y baja presión de vapor, y dio excelentes resultados en nuestros ensayos utilizando la óptica de inmersión de aceite moderado-NA.
Aquí deben hacerse cuatro puntos:
(1) Con pocas excepciones, la situación ideal en microscopía es que el índice de refracción de la muestra debe ser igual al índice de refracción del fluido de inmersión objetivo de la lente17,18,13. Para estudios de imágenes tridimensionales (3D) donde el enfoque profundo es necesario, esto siempre es importante.
(2) Nuestro resultado experimental para una limpieza óptima (n .525–1.535) es ligeramente superior a los aceites de inmersión estándar (n a 1.515, 1.518) y, por lo tanto, infringe el punto (1), y por lo tanto introduce una fuente de aberración esférica cuando se utiliza la óptica de inmersión de aceite estándar. Una solución a este problema es el uso de un objetivo diseñado para un índice de inmersión en el rango superior. Debido a un resurgimiento del interés en las muestras limpiadas por imágenes, los objetivos especiales con la corrección necesaria están llegando a estar disponibles. La otra solución es ajustar el índice del medio clarificador hasta 1.515 o 1.518 mediante la adición de una pequeña cantidad de butanol (n a 1.399) para un rendimiento óptimo de inmersión en aceite, y aceptar la claridad ligeramente degradada.
(3) La microscopía de biopelículas intactas (y otros especímenes en esta escala) requiere una distancia de trabajo significativa para acomodar el espesor de la muestra. Esta es una consideración práctica importante. Una larga distancia de trabajo limita la óptica a una apertura numérica moderada (NA – 0.6–1.25), lo que limita la resolución, pero también limita la gravedad de la aberración esférica.
(4) El índice óptimo de refracción para la clarificación puede ser diferente para otros tipos de muestras fijas. Los especímenes deben probarse en consecuencia utilizando contraste de fase y una serie de líquidos de referencia de índice de refracción, como se muestra en la Figura 3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los avances en la microscopía de fluorescencia en seccionamiento óptico, resolución, velocidad, evitación o compensación de la aberración, la adquisición multicanal y en la potencia informática, han causado un resurgimiento de las muestras intactas por imágenes. En el caso de los especímenes fijos, tanto los métodos de clarificación como de expansión clásicos y novedosos han tenido un impacto importante19,20,21,22,23,24. En este caso, aplicamos un enfoque rápido y sencillo de coincidencia de índices a base de disolventes para estudiar la estructura de las biopelículas fúngicas que son muy translúcidas a opacas.
Los protocolos anteriores han sido probados con una gama de muestras. En nuestro laboratorio Las biopelículas Candida albicans se cultivan con mayor frecuencia en cuadrados de 14 mm cortados a partir de una lámina de caucho de silicona de grado médico (ver Tabla de Materiales). Este sustrato se utiliza porque el crecimiento de PDMS (polidimetilsiloxano) sumergido en medio de cultivo líquido se ha establecido como un modelo in vitro importante para las infecciones asociadas con los implantes médicos, particularmente los catéteres habitacionales. Las células estresadas que inician la filamentación se adhieren rápidamente a superficies no polares como PDMS. En la práctica, los cuadrados usados que han sido limpiados y resterilizados en un autoclave (ciclo seco) dan las biopelículas más consistentes para cualquier cepa en particular. Las biopelículas también se cultivan comúnmente en vasos de cobertura, en platos de cultivo de fondo de vidrio de cubierta, en platos de poliestireno de grado bacteriológico estándar y en agar. Debido a que las células de C. albicans no se adhieren bien al vidrio, los vasos de cubierta deben tratarse con una lectina que unirá los polisacáridos de la pared celular. Aplicamos 40 sl de 1 mg/ml de ConA o WGA en agua estéril sobre cada superficie de cubreobjetos. Después del secado, los vasos de cubierta se tratan con 40 ml de glúteo al 1% durante 3 minutos para repasar la proteína en una película insoluble. A continuación, se lavan con agua destilada estéril para eliminar el fijador y cualquier lectina soluble y secado al aire. Si es necesario, los vasos o platos de cubierta tratados se resterilizan bajo una lámpara UV germicida durante 10 min.
El espesor del espécimen afectará los períodos de incubación requeridos en los protocolos. La difusión fija en una biopelícula de 300 m requiere varios minutos para equilibrarse. Este período de tiempo aumenta a medida que el cuadrado del espesor de la muestra, y debe extenderse a una hora o más para biopelículas muy gruesas o muestras de bloque de agar que pueden tener 2-3 mm de espesor. El período de tiempo de equilibrio para la tinción también depende del espesor de la muestra como se describe para la fijación y el lavado. Sin embargo, debido a que las lectinas se difunden más lentamente que los fijadores de bajo MW, especialmente dentro de un gel de agar, la tinción debe extenderse durante la noche. Lo mismo debe hacerse para el lavado de exceso de manchas.
Las manchas de varios tipos pueden incorporarse a los protocolos. Utilizamos una mancha de pared celular para imágenes estructurales, más comúnmente Calcofluor White M2R (Fluor. Brightener #28) o una lectina con etiqueta de tinte como ConA-Alexafluor 594 o WGA-Alexafluor 594. Se debe prestar atención a la valencia de la proteína. El tetrámero ConA puede causar reticulación de hifas altamente flexibles en la región apical de una biopelícula. Esto es menos evidente con el dímero WGA. Las especificidades canónicas de estos marcadores son calcofluor para quitina, ConA para residuos de manona y WGA para residuos de N-acetil-D-glucosamina y ácido siálico.
Debido a que el protocolo de intercambio de disolventes se clasifica a partir de PBS o agua a través del metanol en salicilato de metilo, los envases de muestras deben ser resistentes a los disolventes. El salicilato de metilo (MS) suavizará rápidamente la plasticería de poliestireno y suavizará lentamente otros plásticos. El protocolo se ajusta al uso del metanol limpio se puede llevar a cabo en plástico, pero en ese punto en el protocolo generalmente cambiamos a los viales de centelleo de vidrio estándar de 20 ml con tapas de tornillo resistentes a disolventes. Los viales son convenientes para biopelículas en sustratos cuadrados de silicona, ya que los cuadrados se pueden recoger y transferir utilizando pinzas finas. Además, un vial se puede drenar y rellenar con el cuadrado plano descansando sobre la superficie curva interna para que la biopelícula no entre en contacto con el vidrio. El sustrato debe ser biofilm-up cuando se sumerge en el vial vertical. Los viales son excelentes para el almacenamiento de muestras a largo plazo.
En el protocolo de clarificación, los pasos de intercambio de disolventes más calificados minimizan el riesgo de deformación de la muestra debido a los efectos de mezcla de disolventes. Para la velocidad y la conveniencia en el protocolo básico, hay cuatro pasos: 1) paso 3.3, PBS a 50:50 PBS:metanol; 2) pasos 3.4 y 3.5, PBS:metanol a metanol limpio, 3) paso 3.6, metanol limpio a 50:50 metanol: MS; y 4) los pasos 3.7 y 3.8, metanol:MS a MS. Methanol proporciona la miscibilidad transitoria. Sin embargo, debido a que el agua y la EP son casi inmiscibles, es esencial que toda el agua sea desplazada por el metanol antes de la introducción de cualquier MS. evaporación del metanol residual causará variaciones del índice de refracción dentro de la muestra. Dentro de la secuencia de cuatro pasos, es aconsejable repetir el segundo y el cuarto paso añadiendo otro cambio de disolvente limpio, o incluso un tercer cambio. Para especímenes particularmente frágiles, los cambios de disolvente podrían formularse en pasos porcentuales más pequeños.
Con las muestras de bloque de agar, los pasos 3.4 y 3.5 (metanol limpio) pueden causar la aparición de cristales de sal dentro del agar debido a la insolubilidad de las sales residuales de PBS en el metanol. Esto se puede evitar mediante el uso de agua destilada (DW) en el primer paso de disolvente mezclado en lugar de PBS para diluir las sales durante el agua: intercambio de metanol. La secuencia de intercambio de disolventes alternativos para biopelículas fijas consiste entonces en estos pasos: 1) paso 3.3, transferir la muestra de PBS a 50:50 DW:metanol (permitir tiempo adicional para la difusión a través del agar); 2) paso 3.4, transferir la muestra de 50:50 DW:metanol en metanol limpio (repetir 2x con metanol como en el paso 3.5); 3) paso 3.6, transferir el espécimen de metanol a 50:50 metanol:salicilato de metilo; y 4) paso 3.7, transferir la muestra de 50:50 metanol: MS a mS ordenada (repetir 2x con EM como en el paso 3.8).
Debido a que el salicilato de metilo suaviza rápidamente la cerámica plástica de poliestireno, utilizamos un plato de aluminio anodizado con un fondo de vidrio de cubierta para sostener la biopelícula clarificada en el escenario de un microscopio invertido. El vidrio de la cubierta se mantiene en su lugar utilizando cemento óptico de curado UV (Norland Optical Adhesive #61, ver Tabla de Materiales). Siempre que la EP se retire al final del día lavando el plato con isopropanol seguido de agua jabonosa y enlizado, el vidrio de la cubierta cementada servirá durante muchos meses.
La selección objetiva de lentes es de vital importancia en las imágenes a gran escala de muestras clarificadas debido a la importancia de minimizar la aberración esférica y la necesidad de una distancia de trabajo suficiente. Tenemos experiencia con tres objetivos en estos estudios. En la configuración del microscopio invertido, utilizamos un aceite objetivo de apertura numérica moderada (NA) de larga distancia de trabajo sumergido debajo del cristal de la cubierta con el biofilm sumergido en salicilato de metilo en el plato por encima del cristal de la cubierta. La mayor parte de nuestro trabajo se ha realizado con un objetivo acromático de la serie Zeiss Universal, tipo 461708, 40x 0.85NA Oel 160/1.5, utilizado con un adaptador de distancia focal negativo de 160 mm para compatibilidad nominal conconjugada infinita (IC). Este objetivo fue diseñado originalmente para la visualización inmersa en aceite a través de diapositivas de microscopio de 1,5 mm con 0,35 mm de distancia de trabajo25. Cuando se utiliza con un vidrio de cubierta estándar (0,17 mm), la distancia de trabajo es mucho mayor: 1,5 + 0,35–0,17 a 1,68 mm a 1.680 m. También utilizamos un nuevo objetivo de multiinmersión de Zeiss, tipo 420852, 25x 0.8NA LD LCI Plan-apochromat con una distancia de trabajo superior a 540 m, con la corrección de inmersión establecida en el lado alto de ‘aceite’. Este objetivo está muy corregido y produce una imagen excelente. En un soporte de microscopio vertical, hemos utilizado un nuevo objetivo de multiinmersión Nikon, tipo MRD71120, 10x 0.5NA CFI Plan-apochromat con una distancia de trabajo superior a 5.000 m (5 mm), también con la corrección de inmersión establecida en el lado alto de ‘aceite’ (n a 1.518). Aunque este objetivo tiene un NA más bajo que los otros, tiene la ventaja de ser directamente dimmersible en salicilato de metilo.
Para optimizar la adquisición de datos en términos de velocidad y resolución, la configuración del microscopio confocal idealmente debe cumplir con las densidades de muestreo de Nyquist transversales y axiales18. Usando criterios convencionales, ajuste el diámetro del agujero confocal nominalmente a 1 unidad ventilada. En coordenadas magnificadas,
dP (m) a 1,22 x aumento x (longitud de onda de emisión en ám) / NA
El muestreo transversal (espaciado de píxeles) no debe exceder (1/2) x el límite de resolución de Abbe. En las coordenadas de espacio de objetos,
(longitud de onda de emisión en nm) / (4 NA)
El muestreo axial (incremento de enfoque) no debe exceder el ancho de banda axial inverso,
(índice de inmersión) x (longitud de onda de emisión en nm) / (NA2)
El sistema óptico confocal amplía el ancho de banda del microscopio y agudiza la resolución transversal y axial en al menos 1 / 2.
Para el objetivo de 40x 0.85 NA que utilizamos con más frecuencia, consulte la Tabla 1 para los resultados de estas fórmulas para una longitud de onda de emisión de 600 nm (Alexa Fluor 594).
| Fórmula | x 1 / 2 | conjunto (típico) | |
| dP (m) | 34,5 m | – | 25 o 50 m |
| X, y | 176 nm | 125 nm | 161 nm |
| z’z | 1200 nm | 848 nm | 900 nm |
Tabla 1: Diámetro del agujero confocal, muestreo transversal y valores de muestreo axial para una longitud de onda de emisión de 600 nm.
Utilizando un escáner confocal de disco giratorio con estos ajustes y un campo de escaneo de 1.392 x 1.040 píxeles, los datos de las muestras de biopelícula se pueden adquirir con una velocidad y resolución razonables. Las pilas de imágenes 3D de un solo color típicas ejecutan entre 0,35 y 1,55 GB.
Los medios de clarificación en uso amplio abarcan un rango de índice de refracción significativo. Por iluminación de campo oscuro e inspección visual, encontramos que las biopelículas fijas de C. albicans eran más transparentes por encima de n .5. Esto se refinó mediante la microscopía de contraste de fase a n .530–1.535. Por varias razones prácticas, utilizamos salicilato de metilo (n a 1.537) como disolvente de coincidencia de índice final. Aunque el intercambio de disolventes conlleva el riesgo de deformación de muestras u otros artefactos, las células de las muestras fijas y clarificadas tienen dimensiones similares del cuerpo celular, el diámetro de la hifa y las dimensiones de longitud interseptal que las muestras vivas.
Muchas variaciones en el proceso de intercambio de disolventes son posibles (por ejemplo, utilizando un disolvente transitorio diferente, o un disolvente final diferente). El metanol fue elegido por su alta polaridad y rápida difusión, pero se demostró que el etanol preserva mejor el rendimiento cuántico de proteína fluorescente roja (RFP)26 como disolvente de transición. El salicilato de metilo fue seleccionado por su índice, polaridad moderada, baja presión de vapor y compatibilidad con muchas manchas, colorantes y proteínas fluorescentes. Sin embargo, un disolvente final con un índice ligeramente más bajo, o una mezcla de salicilato de metilo y un disolvente de índice inferior, como el butanol, puede servir mejor.
Inesperadamente, la capacidad de ver a través de una biopelícula revela no sólo sus características internas estratificadas, sino que también ayuda a ver el origen de estructuras extendidas como hifas apicales largas, no enredadas e hifas basales invasivas en ciertos substratos. La virulencia oportunista en C. albicans depende de su versatilidad genética (es decir, el cambio al crecimiento hiplólico, la regulación ascendente del sustrato celular y la adherencia celular, la generación de osmolitos para la floración celular y el alargamiento, y el uso de nutrientes alternativos). La extensión hiphal permite la ruptura de células individuales de C. albicans de células inmunitarias fagocíticas, pero también es esencial para la invasión. La adhesión al biofilm y el entrelazamiento hiphalparecen proporcionar el anclaje superficial necesario para que las hifas invadan eficientemente un sustrato. Cuando ese sustrato es tejido huésped, puede producirse un aumento de la virulencia.
Las biopelículas intactas por imágenes permiten un gran número de experimentos informativos que utilizan cepas de reporteros para la expresión génica, sustratos de tejidos modelo y la inclusión de otros organismos como bacterias que se encuentran en biopelículas naturales. Incluso en el caso más simple de imágenes puramente estructurales con una mancha de pared celular, se revelan fenotipos in situ que luego pueden ser cuantificados y analizados genéticamente.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada en parte por las subvenciones R01 AI067703, R21 AI100270 y R21 AI135178 a A.P. Mitchell. Los autores están agradecidos a Greenfield ‘Kip’ Sluder por proporcionar el objetivo de inmersión en aceite de larga distancia de trabajo utilizado en este trabajo, y a Daniel Shiwarski para la microscopía confocal con inmersión directa de salicilato de metilo.
Materials
| Biohazardous waste receptacle | |||
| Biosafety cabinet with germicidal UV lamp | |||
| Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol) | |||
| Concanavalin A – Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Distilled water | DW | ||
| Distilled water, sterile | |||
| Ethanol, absolute | EtOH | ||
| Fetal bovine serum (FBS), sterile | |||
| Fixative waste bottle in secondary containment | |||
| Formaldehyde 20% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37% | Electron Microscopy Sciences | ||
| Fume hood | |||
| Glutaraldehyde 25% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Incubator – 30 deg C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes | |||
| Incubator – 37 deg C, with orbital mixer for culture plates | |||
| Isopropanol 70% | iPrOH 70% | ||
| Longwave (365 nm) UV lamp, 5Watt | Cole-Parmer Scientific | for curing NOA-61 cement | |
| Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick | Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/ | Non-reinforced medical grade silicone sheeting | |
| Methanol 99.9% | MeOH | ||
| Methyl salicylate 99% | MS | ||
| Millipore Swinnex 13mm white silicone ring gaskets | Millipore Corp. | SX0001301 | |
| Norland UV-curing optical adhesive – type NOA-61 | Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com | NOA-61 | |
| Orbital mixer, benchtop | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | |||
| Refractive index standard liquids, n=1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment) | Cargille Laboratories, https://cargille.com | Series E | Cedar Grove, NJ 07009, USA |
| RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile | |||
| Scintillation vials, 20 mL – Wheaton, Urea cap PE cone cap liner | Fisher Scientific Co. | 03-341-25H | for specimen processing and storage |
| Solvent waste bottle in secondary containment | |||
| Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol) | |||
| Wheat germ agglutinin – Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar) | |||
| YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose) |
Referências
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