הקרנה וזיהוי של רנ א השתקה דכאי מ מופרש העריקים של פתוגנים צמח

במהלך שני העשורים האחרונים, האצת רצף הגנום של מיקרואורגניזמים הגורמות מחלות צמחים הוביל פער ידע הולך וגובר בין מידע רצף ופונקציות ביולוגיות של חלבונים מקודד¹. בין המולקולות שנחשפו על-ידי פרויקטים ברצף הם מולקולות אפקטור לדכא חסינות מולדת ולהקל על הקולוניזציה המארחת; גורמים אלה מופרשים על ידי פתוגנים צמחים הרסניים, כולל חיידקים, nematodes, וחיידקים filamentous. כדי להגיב על איומים אלה, צמחים מארחים התפתחו קולטני הרומן המכירים את העריקים האלה, המאפשרים שחזור של התגובה החיסונית. מכאן, העריקים כפופים ללחצים סלקטיבית שונים, המוביל לגיוון של אפקטור repertoires בקרב הפתוגן שנים². בשנים האחרונות, מנטרל מפתוגנים צמחים הוכחו לשבש הצמח חסינות מולדים על ידי הפרעה תהליכים סלולריים מארח לטובת חיידקים במגוון דרכים, כולל דיסרגולציה של איתות מסלולים, תמלול, הובלה תאיים, יציבות השלד, שלפוחית הסחר, ו RNA השתקה^3,4,5. עם זאת, הרוב המכריע של העריקים הפתוגן, במיוחד אלה של פתוגנים filamentous, נותרו מחוחימים.

רנ א השתקה היא הומולוגיה-בתיווך גן מכונות ההפעלה כי הוא שימור בין eukaryotes. התהליך מופעל על ידי ארוך כפול תקועים RNA (dsRNA) ומטרות RNA הומוולוגי יחיד תקוע (ssRNA) באופן ספציפי רצף, והיא מפעילה מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל הגנה אנטי ויראליות⁶. כדי להתגבר על התגובות החיסונית הטבועה של המארח, וירוסים מסוימים התפתחו לקזז RNA השתקה, כולל היכולת לשכפל בתוך התאים תאיים או לברוח מהאות מאורגן מראש. אף על פי כן, האסטרטגיה הכללית ביותר שבה וירוסים להגן על גנום שלהם נגד rna השתקה תלוי אובדן של הפונקציה gene היא לקודד חלבונים ספציפיים לדכא rna השתקה^7,8. מספר גישות שונות של מכניזיות הוקמו על המסך ואיפיון דכאי ויראלי של RNA השתקה (vsrs), כולל הסתננות של agrobacterium התרבויות tumefaciens , צמחים טרנסגניים להביע דכאי, השתלה ותרבות התא^{9,10,11,12,13}.

לכל אחד מאותם מספר יש יתרונות וחסרונות, ומזהה VSRs באופן ייחודי משלו. אחת הגישות הנפוצות ביותר מבוססת על חדירה משותפת של הפרט A. tמואfaciens תרבויות מחסה את החלבון הנגיפי הפוטנציאלי גן עיתונאי (בדרך כלל חלבון פלורסנט ירוק [gfp]) על טבק benthamiana 16c צמחים ביטוי המבטא gfp תחת השליטה של וירוס פסיפס כרובית של מקדם 35. בהעדר משתיק קול ויראלי פעיל, GFP מזוהה כאקסוגני על ידי התאים המארחים והוא מושתק בתוך 3 ימים לאחר הסתננות (dpi). לעומת זאת, אם החלבון הנגיפי מחזיק בפעילות הדיכוי, רמת הביטוי של GFP נותרת יציבה מעבר ל -3 עד 9 dpi⁹. שיתוף החדירה המשותף הזה הוא פשוט ומהיר; עם זאת, הוא לא יציב מאוד ולא רגיש. עם זאת, את השיטת זיהה vsrs רבים עם רצפי חלבון מגוונים ומבנים רבים RNA וירוסים^7,8.

לאחרונה, כמה חלבונים אפקטור שיכולים לעכב את הפעילות התאית השתקה הסלולר כבר מאופיין חיידקי, o, ופטריות צמח פתוגנים^14,15,16. ממצאים אלה משתמע כי רנ א השתקה הדיכוי היא אסטרטגיה נפוצה להקלה על זיהום המשמש פתוגנים ברוב הממלכות. בתאוריה, רבים, אם לא כולם, של העריקים עשויים לקודד RNA השתקה דכאי (RSSs); עד כה, לעומת זאת, רק מעטים זוהו, בעיקר בשל המחסור באסטרטגיית ההקרנה האמינה והכללית. יתר על כן, דכאי של RNA השתקה לא נחקרו ברוב המכריע של פתוגנים צמחים¹⁷.

בדו ח זה, אנו מציגים פרוטוקול ממוטב וכללי לזיהוי הפתוגן הגורם למחלה שיכול לדכא RNA מקומי ומערכתי השתקה באמצעות שיטת החדירה אגרו. המטרה הראשונה של מחקר זה הייתה להדגיש את ההיבטים המרכזיים של הפרוטוקול ולתאר את השלבים בפרוטרוט, ובכך לספק מבחן הקרנה המתאים לכמעט כל העריקים של פתוגנים צמחיים.