미세 혈관 내피 세포를 통해 미생물 통과에 의해 혈액 - 뇌 장벽의 투과성 분석

1. 완충제 및 시약 의 준비 염화나트륨 80g(NaCl), 염화칼륨 2g(KCl), 14.4g의 디나트륨-수소-인산염 디하이드레이트(Na2 HPO4 · 2H2O)및 2를 첨가하여 10x 인산완충액(10x PBS)을 준비합니다. g의 칼륨-디수소 인산염(KH2 PO4)을1L 의 유리 플라스크에 1L의 이중 증류H2O. 오토클레이브 10x PBS 용액을 및 이중 증류수900 mL에서 100 mL로 희석하여 1x PBS를 얻습니다. 오토클레이브를 사용하여 용액을 살균합니다. 유리 플라스크를 바구니에 넣고 뚜껑을 닫고 121 °C 및 98.9 kPa에서 15 분 동안 살균하십시오.참고: 이 프로토콜은 항상 추가 단계에서 솔루션을 오토클레이브하는 데 사용됩니다. 0.5 mg/mL 섬유넥틴 용액과 0.3 mg/mL 콜라겐 IV 용액을 1.5 mL 마이크로 튜브에서 100 mg/μL aliquots로 각각 희석하여 10 μg/mL 콜라겐 IV 및 10 μg/mL fibronectin 용액을 준비합니다. 그 후, 2 mL 마이크로 튜브에 1,800 μL의 1,800 μL과 두 개의 양현서를 혼합하고 -20 °C에 저장합니다. DMEM/F-12 배지를 4% 태아 소 혈청과 2 mM L-글루타민 및 100 mg/L 페니실린/스트렙토마이신을 배지에 첨가하여 4°C에 보관합니다. 10x 농축 트립신-EDTA 용액의 5 mL을 50 mL 튜브에 45 mL의 1x PBS로 희석하여 1x 트립신-EDTA 용액을 50 mL 튜브에 저장하여 1x 트립신-EDTA 용액을 준비합니다. 500 mL 유리 플라스크에 LB 국물 베이스 10g의 무게로 LB 배지 500 mL를 준비합니다. 멸균수 500mL를 넣고 오토클레이브합니다. LB 국물 베이스 10g과 한천 7.5 g을 500 mL 유리 플라스크에 넣고 LB 한천을 준비합니다. 오토클레이브 전에 멸균된 물 500mL를 추가하고 플라스크 뚜껑을 닫지 마십시오. 오토클레이브를 하고 용액이 따뜻해질 때까지 식힙니다. 4% 태아 소 혈청과 2 mM L-글루타민을 첨가하여 항생제 없는 배지를 준비하지만, DMEM/F-12 배지에 페니실린/스트렙토마이신이 없고 1.3단계에서와 같이 4°C에 보관한다. 2. 세포를 모방 하는 혈액-뇌 장벽의 성장 12개의 웰 플레이트를 조립하려면, 세포 배양 삽입을 웰에 넣는다(도2A). 생물학적 안전 캐비닛에 플레이트와 각 인서트를 압축을 풀고 추가 단계를 수행합니다. 멸균 된 집게를 사용하여 넓은 베이스에서 인서트를 잡고 이동하십시오. 각 삽입물의 다공성 멤브레인을 90 μL의 10 μg/mL 콜라겐 IV와 10 μg/mL 피브로넥틴 혼합물로 코팅합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 24시간 동안 12웰 플레이트를 배양하였다(도2B). 각 인서트에 1mL의 1mL를 파이펫팅하여 인서트를 두 번 세척하고 셀 배양용 진공 펌프로 용액을 흡인합니다. 상부에 미리 온지어 DMEM/F-12 배지0.5 mL, 하부 챔버에서 1.5 mL를 파이펫팅하여 멤브레인을 평형화합니다. 37°C에서 30분 동안 플레이트를 5%CO2 분위기로 세포 배양 인큐베이터에서 배양하였다(도2C). 종자 2 x 105 인간 미세 혈관 내피 세포를 각 상부 챔버 내로 넣고 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 12웰 플레이트를 배양한다(도2D). 세포 배양용 진공 펌프를 이용하여 세포 배양 플라스크로부터 배지를 흡인하고 1x PBS의 10 mL를 파이펫팅하고 이후에 진공 펌프로 용액을 흡인하여 단층을 세척한다. 용액의 5 mL을 세포 배양 플라스크내로 피펫팅하여 1x 농축 트립신-EDTA로 세포를 완전히 덮습니다. 플라스크를 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 3-5분 동안 배양한다.참고: 세포가 해리되지 않으면 손바닥에 플라스크를 단단히 눌러 세포를 빼내세요. 15 mL 튜브에서 세포 현탁액으로부터 의aliquot로 피펫으로 5 mL을 취하고 효소 반응을 중지하기 위해 FCS 함유 배지의 5 mL를 추가합니다. 210 x g에서3 분 동안 현탁액을 원심 분리하고 진공 펌프로 상급자를 제거하고 파이펫으로 5 mL의 매체에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 셀 카운터를 1.5 mL 마이크로 튜브에 0.4% 트리판 블루 얼룩의 10 μL과 10 μL로 혼합하여 사용한다. 혼합물의 10 μL을 계수 챔버 슬라이드에 넣고 셀 카운터에 넣고 계수를 시작합니다. 카운터를 셀에 집중하여 가장자리가 진한 파란색이고 중간 흰색이 되도록 합니다. 그 후, 세포 계산에 적합한 프로그램을 시작합니다. 각 인서트가 차지하는 부피를 계산하려면 인서트가 얻은 2 x 105 셀을 셀 현탁액의 계산된 농도로 나눕니다. 3. 혈액 뇌 장벽 모델 의 재배 37°C에서 14일 동안 12웰 플레이트를 배양하였다. 상부 챔버에 대한 배지의 0.5 mL및 2-3 일마다 하부에 대한 배지의 1.5 mL를 변경합니다. 배지를 세포 플라스크에 넣기 전에 따뜻하게 합니다. 진공 펌프와 흡인(그림 2E).참고: 멤브레인이 닿지 않도록 주의 깊게 작업하십시오. 현미경으로 그(것)들을 화상 진찰에 의하여 세포의 상태를 확인하고 conflues를 결정합니다. 14일 후 동급이 100%인지 확인합니다. 4. 박테리아의 준비 측정 하루 전에, 대장균 균주 GM2163의 콜로니를 LB 배지에 넣었다. 배양튜브를 37°C에서 24시간 동안 배양쉐이커에서 180 rpm으로 인큐베이션쉐이커(도2F)로배양한다. 4 °C에서 LB 한천 플레이트에 대장균 변형을 경작. 멸균된 픽으로 1개의 콜로니를 취하고 3 mL의 LB 배지로 제조된 배양 튜브에 픽을 넣습니다. 따뜻한 LB 한천 용액으로 각 인서트에 대해 LB 한천 접시를 준비하고 페트리 접시를 전체 부피의 절반으로 채웁니다. 그들이 단단해지고 4 °C에 보관하십시오. 5. 세포의 치료 14일째에, 파종 후, 세포를 화합물로 치료하거나 계획된 경우 경피전기저항(TEER)을 측정한다(도2G).참고 : 항상 대조군으로 치료되지 않은 세포를 가지고 있습니다. 관심 있는 화합물로 세포를 치료하려면 화합물을 DMEM/F-12 배지의 최종 농도로 희석합니다. 이 혼합물의 0.5 mL을 상부 챔버에 넣고 1.5 mL를 하부 챔버에 넣습니다. 원하는 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양한다. 그 후, 진공 펌프 및 파이펫팅(그림2H)을흡입하여 완전 배지를 항생제 없는 배지와 교환한다. 6. 투과성 측정 박테리아의 일정한 농도를 얻으려면 600 nm의 파장에서 광계로 광학 밀도를 측정하십시오. 50 mL 팔콘 튜브에서 LB 배지로 박테리아의 하룻밤 용액을 0.5±0.05의 OD600으로 희석한다. 얼음에 작업. LB 배지 1mL를 큐벳에 채웁니다. 포토미터를 시작하고 큐벳을 앞으로 표시된 쪽에 넣습니다. 나중에 빈 값을 측정하기 위해 아래쪽”공백”을누릅니다. 큐벳에 채우고, 넣고, 바닥 샘플을 눌러 박테리아 용액의 밀도를 측정합니다. 최종 농도를 얻을 때까지 희석 시 측정을 반복한다. OD600 = 0.5에서 제조 된 12 웰 플레이트 및 세균 용액으로 박테리아를 처리 할 수있는 생물학적 안전 캐비닛에서 작동합니다. 배지0.5 mL을 함유하는 각 상부 챔버에만 450 μL의 세균 용액을첨가한다(도2I). 인큐베이터에서 37°C에서 6시간 동안 12웰 플레이트를 배양한다.참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지하도록 지시합니다. 각 하부 챔버로부터 파이펫을 사용하여 배지의 50 μL을 집게로 인서트를 제거하였다(도2J). 상부 챔버에서 하부 챔버로 매질을 흘리지 않도록주의하십시오. 각 샘플을 별도의 한천 판상에플레이트(도 2K). 샘플을 플레이트에 떨어뜨리고 셀 스프레더로 용액을 줄무늬. 인큐베이터에서 37°C에서 24시간 동안 한천 판을 배양한다. 각 접시의 식민지를계산합니다(그림 2L). 7. 데이터 분석 테이블에 데이터를 작성하고 처리 및 치료되지 않은 세포의 관찰 된 콜로니의 평균 및 표준 편차를 계산합니다. 평균을 절대 콜로니 수로 표시합니다. 결과를 정규화하려면 모든 결과를 컨트롤 값으로 나누어 상대적인 콜로니 수를 계산합니다. 그림 2: 프로토콜의 개별 단계에 대한 자세한 프레젠테이션입니다. (A)멸균된 집게가 있는 인서트를 12개의 웰 플레이트에 넣습니다. (B)각 삽입물마다 섬유넥틴과 콜라겐 IV 혼합물90 μL을 코팅하고 24시간 동안 배양하고(C)30분 동안 미리 온화한 배지로 막을 평형화시켰다.(D)씨앗 2 x 105 인간 뇌 미세혈관 내피 세포를 삽입당. (E)적절한 시간 동안 접시를 경작한다. (F)측정 하기 하루 전에, LB 배지 배양 튜브에 대장균 콜로니를 넣고 24 시간 동안 배양 (G)세포를 치료하거나 TEER을 측정하십시오. (H)항생제없는 배지로 완전한 배지를 교환하십시오. (I)세균 용액 (OD600 = 0.5)의 450 μL을 각 상부 챔버에 넣고 6 시간 동안 배양합니다.(J)포셉으로 인서트를 제거하는 각 하부 챔버에서 배지 50 μL을 배양하십시오. (K)한천 접시에 샘플을 접시에 접시와 24 시간 동안 배양 . (L)식민지를 계산하고 데이터를 분석한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.