Isolatie, cultuur en adipogene inductie van neurale crest originele vet-afgeleide stamcellen uit periaortic vetweefsel
Summary
We presenteren een protocol voor de isolatie, cultuur en adipogene inductie van neurale kam afgeleide vet-afgeleide stamcellen (NCADSCs) uit de periaortische vetweefsel van Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ muizen. De NCADSCs kunnen een gemakkelijk toegankelijke bron van ADSCs voor het modelleren van adipogenese of lipogenese in vitro.
Abstract
Een overmatige hoeveelheid vetweefsel rond de bloedvaten (perivasculair vetweefsel, ook bekend als PVAT) wordt geassocieerd met een hoog risico op hart- en vaatziekten. Adscs afgeleid van verschillende vetweefsel tonen verschillende kenmerken, en die van de PVAT zijn niet goed gekarakteriseerd. In een recente studie, rapporteerden we dat sommige ADSCs in de periaortische boog vetweefsel (PAAT) afstammen van de neurale crest cellen (NCCs), een voorbijgaande populatie van migrerende cellen afkomstig uit het ectoderm.
In dit artikel beschrijven we een protocol voor het isoleren van rode fluorescerende eiwitten (RFP)-gelabelde NCCs van de PAAT van Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ muizen en het opwekken van hun adipogene differentiatie in vitro. Kortom, de stromal vasculaire fractie (SVF) is enzymatisch gescheiden van de PAAT, en de RFP+ neuralcrest afgeleide ADSCs (NCADSCs) worden geïsoleerd door fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS). De NCADSCs onderscheiden zich in zowel bruine als witte adipocyten, kunnen worden cryopreserved, en behouden hun adipogene potentieel voor ~ 3-5 passages. Ons protocol kan genereren overvloedige ADSCs uit de PVAT voor het modelleren pvat adipogenese of lipogenese in vitro. Zo kunnen deze NCADSCs een waardevol systeem bieden voor het bestuderen van de moleculaire schakelaars die betrokken zijn bij PVAT-differentiatie.
Introduction
De prevalentie van obesitas neemt wereldwijd toe, wat het risico op gerelateerde chronische ziekten, waaronder hart- en vaatziekten en diabetes1, verhoogt. PVAT omringt bloedvaten en is een belangrijke bron van endocriene en paracrine factoren die betrokken zijn bij vasculatuur functie. Klinische studies tonen aan dat een hoog PVAT-gehalte een onafhankelijke risicofactor is van hart- en vaatziekten2,3, en de pathologische functie ervan hangt af van het fenotype van de van bestanddelen afgeleide stamcellen (ADSCs)4.
Hoewel ADSC-cellijnen zoals de murine 3T3-L1, 3T3-F442A en OP9 nuttige cellulaire modellen zijn om adipogenese of lipogenese5te bestuderen, verschillen de regulerende mechanismen voor adipogenese tussen cellijnen en primaire cellen. De ADSCs in de stromal vasculaire celfractie (SVF) rechtstreeks geïsoleerd van vetweefsel en ertoe aangezet om zich te onderscheiden in adipocyten waarschijnlijk samenvatten in vivo adipogenese en lipogenese6. Echter, de kwetsbaarheid, drijfvermogen, en de variaties in grootte en immunophenotypes van de ADSCs maken hun directe isolatie uitdagend. Bovendien kunnen de verschillende isolatieprocedures ook een aanzienlijke invloed hebben op het fenotype en het adipogene potentieel van deze cellen7,waardoor de nadruk wordt gelegd op de noodzaak van een protocol dat de ADSC-integriteit handhaaft.
Vetweefsel wordt meestal geclassificeerd als ofwel de morfologische en functioneel onderscheiden wit vetweefsel (WAT), of de bruine vetweefsel (BBT)8, die verschillende ADSCs herbergt9. Terwijl ADSCs geïsoleerd van perigonadale en inguinal onderhuidse WAT’s zijn gekenmerkt in eerdere studies9,10,11,12, minder bekend is met betrekking tot de ADSCs van PVAT die voornamelijk bestaat uit BAT13.
In een recente studie, vonden we dat een deel van de ingezetene ADSCs in de periaortische boog vetweefsel (PAAT) zijn afgeleid van neurale crest cellen (NCCs), een voorbijgaande populatie van migrerende voorlopercellen die afkomstig zijn van de ectoderm14,15. Wnt1-Cre transgene muizen werden gebruikt voor het traceren van neurale crest cel ontwikkeling16,17. We staken Wnt1-Cre+ muizen over met Rosa26RFP/+ muizen om Wnt-1 Cre+/-te genereren; Rosa26RFP/+ muizen, waarin NCC’s en hun nakomelingen zijn gelabeld met rood fluorescerend eiwit (RFP) en gemakkelijk in vivo en in vitro15worden bijgehouden. Hier beschrijven we een methode voor het isoleren van neurale kam afgeleide ADSCs (NC-afgeleide ADSCs, of NCADSCs) van muis PAAT en induceren de NCADSCs om zich te onderscheiden in witte adipocyten of bruine adipocyten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie presenteren we een betrouwbare methode voor de isolatie, cultuur en adipogene inductie van NCADSCs uit de PVAT van Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ transgene muizen ontworpen om RFP+ ADSCs te produceren. Uit eerdere rapporten blijkt dat er geen significant verschil is in de expressie van algemene multipotente mesenchymale stamcellen (MPC’s) in NCADSCs en niet NCADSCs22, en dat NCADSCs een sterk potentieel hebben om zich te onderscheiden in adipocyten in vit…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Key R&D-programma van China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293) en Science and Technology Commission van shanghai Gemeente (17411971000, 17140902402) verstrekten de fondsen voor deze studie .
Materials
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
Referências
- Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Britton, K. A., et al. Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study. Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Cinti, S. Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation. Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Chen, Y., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
- Medeiros, D. M. The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).
- Fu, M., et al. Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Tamura, Y., et al. Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).
- Billo, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).
