Aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de células madre originales adiposas de raíz de la cresta neuronal del tejido adiposorio
Summary
Presentamos un protocolo para el aislamiento, el cultivo y la inducción adipogénica de células madre derivadas de cresta neural derivadas de la cresta adiposa (NCADSC) del tejido adiposorio periaortico de Wnt-1 Cre+/-; Ratones Rosa26RFP/+. Los NCADSC pueden ser una fuente de aXenatos de fácil acceso para modelar adipogénesis o lipogénesis in vitro.
Abstract
Una cantidad excesiva de tejido adiposo que rodea los vasos sanguíneos (tejido adiposo perivascular, también conocido como PVAT) se asocia con un alto riesgo de enfermedad cardiovascular. Los ADSC derivados de diferentes tejidos adiposos muestran características distintas, y los del PVAT no han sido bien caracterizados. En un estudio reciente, informamos que algunos ADSC en el tejido adiposo del arco periaortico (PAAT) descienden de las células de la cresta neural (NCC), una población transitoria de células migratorias que se originan en el ectodermo.
En este artículo, describimos un protocolo para aislar los CNC etiquetados con proteína fluorescente roja (RFP) del PAAT de Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ ratones e inducir su diferenciación adipogénica in vitro. Brevemente, la fracción vascular estromal (SVF) se disocia enzimáticamente del PAAT, y los ADSC derivados de cresta neural RFP+ (NCADSC) se aíslan por la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Los NCADSC se diferencian en adipocitos marrones y blancos, pueden ser crioconservados, y conservan su potencial adipogénico para pasajes de 3-5 euros. Nuestro protocolo puede generar abundantes ADSC del PVAT para modelar la adipogénesis PVAT o la lipogénesis in vitro. Por lo tanto, estos NCADSC pueden proporcionar un sistema valioso para el estudio de los interruptores moleculares involucrados en la diferenciación PVAT.
Introduction
La prevalencia de la obesidad está aumentando en todo el mundo, lo que aumenta el riesgo de enfermedades crónicas relacionadas, incluidas las enfermedades cardiovasculares y la diabetes1. PVAT rodea los vasos sanguíneos y es una fuente importante de factores endocrinos y paracrinos involucrados en la función de la vasculatura. Los estudios clínicos muestran que el alto contenido de PVAT es un factor de riesgo independiente de enfermedad cardiovascular2,3, y su función patológica depende del fenotipo de las células madre derivadas de la adiposa constituyente (ADSC)4.
Aunque las líneas celulares ADSC como la murino 3T3-L1, 3T3-F442A y OP9 son modelos celulares útiles para estudiar la adipogénesis o lipogénesis5, los mecanismos reguladores de la adipogénesis difieren entre las líneas celulares y las células primarias. Los ADSC en la fracción de células vasculares estromales (SVF) se aislaron directamente de los tejidos adiposos e indujeron a diferenciarse en adipocitos probablemente recapitulan in vivo adipogénesis y lipogénesis6. Sin embargo, la fragilidad, la flotabilidad y las variaciones en el tamaño y los inmunofenotipos de los ADSC hacen que su aislamiento directo sea un reto. Además, los diferentes procedimientos de aislamiento también pueden afectar significativamente el fenotipo y la capacidad potencial adipogénica de estas células7,haciendo hincapié así en la necesidad de un protocolo que mantenga la integridad ADSC.
El tejido adiposo se clasifica típicamente como el tejido adiposo blanco morfológica y funcionalmente distinto (WAT), o el tejido adiposo marrón (BAT)8,que alberga distintos ADSC9. Mientras que los ADSC aislados de WAT subcutáneos perigonadal e inguinales se han caracterizado en estudios anteriores9,10,11,12, menos se sabe con respecto a los ADSC de PVAT que se compone principalmente de BAT13.
En un estudio reciente, encontramos que una parte de los ADSC residentes en el tejido adiposo del arco periaortico (PAAT) se derivan de las células de la cresta neural (NCC), una población transitoria de células progenitoras migratorias que se originan en el ectoderm14,15. Los ratones transgénicos Wnt1-Cre se utilizaron para rastrear el desarrollo de células de cresta neural16,17. Cruzamos Wnt1-Cre+ ratones con ratones Rosa26RFP/+ para generar Wnt-1 Cre+/-; Ratones Rosa26RFP/+, en los que los CNC y sus descendientes están etiquetados con proteína fluorescente roja (RFP) y se rastrean fácilmente in vivo e in vitro15. Aquí, describimos un método para aislar los ADSC derivados de cresta neural (ADSC derivados de NC, o NCADSC) del PAAT del ratón e inducen a los NCADSC a diferenciarse en adipocitos blancos o adipocitos marrones.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, presentamos un método fiable para el aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de NCADSC extraídos del PVAT de Wnt-1 Cre+/-; Ratones transgénicos Rosa26RFP/+ diseñados para producir RFP+ ADSC. Los informes anteriores muestran que no hay ninguna diferencia significativa en la expresión de marcadores generales de células madre mesenquimales multipotentes (MSC) en NCADSCs y no NCADSCs22, y que los NCADSC tienen un fuerte potencial para dife…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Key R&D Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293), y la Comisión de Ciencia y Tecnología del Municipio de Shanghái (17411971000, 17140902402) proporcionó los fondos para este estudio .
Materials
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
Referências
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