Une nouvelle boîte à outils pour évaluer les fonctions des gènes à l’aide de la stabilisation cas9 conditionnelle
Summary
Nous décrivons ici un outil d’édition du génome basé sur la stabilisation temporelle et conditionnelle de la protéine 9 (Cas9) associée à la répétition palindromique courte (CRISPR-) groupée régulièrement espacée sous la petite molécule Shield-1. La méthode peut être utilisée pour des cellules cultivées et des modèles animaux.
Abstract
La technologie CRISPR/Cas9 (CRISPR/Cas9) associée à la répétition palindromique courte et régulièrement intercalée en grappes est devenue un outil de laboratoire répandu pour introduire des modifications précises et ciblées dans le génome. Son énorme popularité et sa propagation rapide sont attribuées à sa facilité d’utilisation et à sa précision par rapport à ses prédécesseurs. Pourtant, l’activation constitutive du système a des applications limitées. Dans cet article, nous décrivons une nouvelle méthode qui permet un contrôle temporel de l’activité CRISPR/Cas9 basé sur la stabilisation conditionnelle de la protéine Cas9. La fusion d’un mutant artificiel de la protéine de liaison à la rapamycine FKBP12 en Cas9 (DD-Cas9) permet la dégradation rapide de Cas9 qui à son tour peut être stabilisée par la présence d’un ligand synthétique FKBP12 (Shield-1). Contrairement à d’autres méthodes inductibles, ce système peut être facilement adapté pour générer des systèmes bi-cistroniques afin de co-exprimer DD-Cas9 avec un autre gène d’intérêt, sans régulation conditionnelle du second gène. Cette méthode permet la génération de systèmes traçables ainsi que la manipulation parallèle et indépendante d’allèles ciblés par la nucléase Cas9. La plate-forme de cette méthode peut être utilisée pour l’identification et la caractérisation systématiques de gènes essentiels et l’interrogation des interactions fonctionnelles des gènes in vitro et in vivo.
Introduction
CRISPR-Cas9 qui signifie «clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9» a été découvert pour la première fois dans le cadre d’études sur l’immunité adaptative bactérienne1,2. Aujourd’hui, CRISPR/Cas9 est devenu l’outil le plus reconnu pour l’édition programmable de gènes et différentes itérations du système ont été développées pour permettre des modulations transcriptionnelles et épigénétiques3. Cette technologie permet la manipulation génétique très précise de presque toutes les séquences d’ADN4.
Les composants essentiels de toute édition de gène CRISPR sont une séquence d’ARN guide personnalisable et la nucléase Cas95. Le guide de l’ARN se lie à la séquence cible-complémentaire dans l’ADN, dirigeant la nucléase Cas9 pour effectuer une rupture double brin à un point spécifique du génome3,4. Le site de clivage résultant est ensuite réparé par jonction finale non homologue (NHEJ) ou réparation dirigée par homologie (HDR), avec l’introduction conséquente de changements dans la séquence d’ADN ciblée5.
L’édition de gènes basée sur CRISPR / Cas9 est facile à utiliser et relativement peu coûteuse par rapport aux techniques d’édition de gènes précédentes et il a été prouvé qu’elle était à la fois efficace et robuste dans une multiplicité de systèmes2,4,5. Pourtant, le système présente certaines limites. Il a souvent été démontré que l’expression constitutive de Cas9 entraîne une augmentation du nombre de hors-cibles et une toxicité cellulaire élevée4,6,7,8. De plus, le ciblage constitutif des gènes essentiels et de survie cellulaire par Cas9 enlève de sa capacité à effectuer certains types d’études fonctionnelles telles que les études cinétiques de la mort cellulaire7.
Différents outils CRISPR-Cas9 inductibles ou contrôlés conditionnellement ont été développés pour résoudre ces problèmes6,tels que Tet-ON et Tet-Off9; recombinaison spécifique au site10; proximité induite chimiquement11; épissage dépendant de l’intein3; et les systèmes de localisation nucléaire à base de récepteurs d’œstrogènes (ER) à base de 4-hydroxytamoxifènes12. En général, la plupart de ces procédures (épissage des intégrines et systèmes de séparation de proximité induits chimiquement) n’offrent pas de contrôle réversible, présentent une réponse cinétique très lente au traitement médicamenteux (système Tet-On/Off) ou ne se prêtent pas à une manipulation à haut débit6.
Pour remédier à ces limitations, nous avons développé une nouvelle boîte à outils qui fournit non seulement une édition de gènes rapide et robuste contrôlée dans le temps, mais assure également la traçabilité, l’accordabilité et l’adaptabilité à la manipulation de gènes à haut débit. Cette nouvelle technologie peut être utilisée dans les lignées cellulaires, les organoïdes et les modèles animaux. Notre système est basé sur un domaine d’ingénierie, lorsqu’il est fusionné à Cas9, il induit sa dégradation rapide. Cependant, il peut être rapidement stabilisé avec une petite molécule hautement sélective, non toxique et perméable aux cellules. Plus précisément, nous avons conçu le mutant humain FKBP12 « domaine déstabilisant » (DD) à Cas9, marquant Cas9 pour une dégradation rapide et constitutive via le système ubiquitine-protéasome lorsqu’il est exprimé dans des cellules de mammifères13. Le ligand synthétique DD, Shield-1 peut stabiliser la conformation DD, empêchant ainsi la dégradation des protéines fusionnées en DD (telles que Cas9) de manière très efficace, et avec une réponse cinétique rapide14,15. Il est à noter que Shield-1 se lie avec trois ordres de grandeur plus étroitement au mutant FKBP12 qu’à son homologue de type sauvage14.
La paire DD-Cas9/Shield-1 peut être utilisée pour étudier l’identification et la caractérisation systématiques des gènes essentiels dans les cellules cultivées et les modèles animaux, comme nous l’avons montré précédemment en ciblant conditionnellement le gène CypD, qui joue un rôle important dans le métabolisme des mitochondries; EGFR, acteur clé de la transformation oncogénique ; et Tp53, un gène central dans la réponse aux dommages à l’ADN. En plus de l’édition de gènes contrôlée temporellement et conditionnellement, un autre avantage de la méthode est que la stabilisation de DD-Cas9 est indépendante de sa transcription. Cette caractéristique permet la co-expression, sous le même promoteur, de marqueurs traçables ainsi que de recombinases, telles que la recombinase dépendante des récepteurs d’œstrogènes, CREER. Dans ce travail, nous montrons comment notre méthode peut être utilisée avec succès in vitro, pour cibler conditionnellement par exemple, le gène de réplication de l’ADN, RPA3.
Protocol
Representative Results
Discussion
La technologie CRISPR/Cas9 a révolutionné la capacité d’interroger fonctionnellement les génomes2. Cependant, l’inactivation des gènes entraîne souvent une létalité cellulaire, des déficits fonctionnels et des défauts de développement, ce qui limite l’utilité de telles approches pour l’étude des fonctions des gènes7. De plus, l’expression constitutive de Cas9 peut entraîner une toxicité et la génération d’effets hors cible6</s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les anciens membres de notre laboratoire et le scientifique Serif Senturk pour leurs travaux antérieurs. Nous remercions Danilo Segovia d’avoir lu ce manuscrit de manière critique. Cette étude a été possible et soutenue par Swim Across America et le programme Cancer Target Discovery and Development Center du National Cancer Institute.
Materials
| 100mM DTT | Thermosfisher | ||
| 10X FastDigest buffer | Thermosfisher | B64 | |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | M0202S | |
| colorimetric BCA kit | Pierce | 23225 | |
| DMEM, high glucose, glutaMax | Thermo Fisher | 10566024 | |
| FastAP | Thermosfisher | EF0654 | |
| FastDigest BsmBI | Thermosfisher | FD0454 | |
| Flag [M2] mouse mAb | Sigma | F1804-50UG | |
| Genomic DNA extraction kit | Macherey Nagel | 740952.1 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| oligonucleotides | Sigma Aldrich | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polybrene | Sigma Aldrich | TR-1003-G | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit | Qiagen | 28506 | |
| secondary antibodies | LICOR | ||
| Shield-1 | Cheminpharma | ||
| Stbl3 competent bacterial cells | Thermofisher | C737303 | |
| SURVEYOR Mutation Detection Kit | Transgenomic/IDT | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273S | |
| α-tubulin [DM1A] mouse mAb | Millipore | CP06-100UG |
Referências
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