CRISPR-Cas9 som står for“clustered regular interspaced short palindromic repeats-associated protein 9” ble først oppdaget som en del av studier på bakteriell adaptiv immunitet^1,2. I dag har CRISPR/Cas9 blitt det mest anerkjente verktøyet for programmerbar genredigering, og forskjellige iterasjoner av systemet er utviklet for å tillate transkripsjons- og epigenetiske moduler³. Denne teknologien muliggjør den svært presise genetiske manipuleringen av nesten hvilken som helst sekvens av DNA⁴.

De viktigste komponentene i enhver CRISPR genredigering er en tilpassbar guide RNA-sekvens og Cas9-kjernen⁵. RNA-guiden binder seg til den mål-komplementære sekvensen i DNA-et, og leder Cas9-kjernen til å utføre en dobbeltstrengspause på et bestemt punkt i genomet^3,4. Det resulterende spaltingsstedet repareres deretter ved ikke-homolog ende-sammenføyning (NHEJ) eller homologi-rettet reparasjon (HDR), med den påfølgende innføringen av endringer i den målrettede DNA-sekvensen⁵.

CRISPR/Cas9-basert genredigering er enkel å bruke, og relativt billig sammenlignet med tidligere genredigeringsteknikker, og det har vist seg å være både effektivt og robust i et mangfold av systemer^2,4,5. Likevel presenterer systemet noen begrensninger. Det konstituerende uttrykket for Cas9 har ofte vist seg å resultere i et økt antall off-targets og høy celletoksisitet^4,6,7,8. I tillegg tar den konstituerende målrettingen av essensielle og celleoverlevelsesgener av Cas9 bort fra sin evne til å utføre visse typer funksjonelle studier som kinetiske studier av celledød⁷.

Ulike inducible eller betinget kontrollerte CRISPR-Cas9-verktøy er utviklet for å løse disse problemene⁶, for eksempel Tet-ON og Tet-Off⁹; områdespesifikk rekombinasjon¹⁰; kjemisk indusert nærhet¹¹; intein avhengig skjøting³; og 4-Hydroxytamoxifen østrogenreseptor (ER) baserte kjernefysiske lokaliseringssystemer¹². Generelt tilbyr de fleste av disse prosedyrene (intein skjøting og kjemisk indusert nærhet splitt systemer) ikke reversibel kontroll, presentere en svært langsom kinetisk respons på narkotikabehandling (Tet-On / Off system), eller er ikke egnet til høy-gjennomstrømning manipulasjon⁶.

For å løse disse begrensningene utviklet vi et nytt verktøysett som ikke bare gir rask og robust temporalkontrollert genredigering, men som også sikrer sporbarhet, tunability og egnethet til genmanipulering med høy gjennomstrømning. Denne nye teknologien kan brukes i cellelinjer, organoider og dyremodeller. Systemet vårt er basert på et konstruert domene, når det smeltes sammen til Cas9, induserer det sin raske nedbrytning. Det kan imidlertid raskt stabiliseres med et svært selektivt, ikke-giftig, cellegjennomtrengelig lite molekyl. Mer spesifikt konstruerte vi det menneskelige FKBP12 mutant “destabiliserende domenet” (DD) til Cas9, og markerte Cas9 for rask og konstituerende nedbrytning via allestedsnærværende proteasomsystemet når det uttrykkes i pattedyrceller¹³. DD syntetisk ligand, Shield-1 kan stabilisere DD-konformasjon, og dermed forhindre nedbrytning av proteiner smeltet til DD (som Cas9) på en svært effektiv måte, og med en rask kinetisk respons^14,15. Vær oppmerksom på at Shield-1 binder seg med tre størrelsesordener strammere til mutanten FKBP12 enn til den ville motparten¹⁴.

DD-Cas9/Shield-1-paret kan brukes til å studere systematisk identifisering og karakterisering av essensielle gener i dyrkede celler og dyremodeller som vi tidligere viste ved betinget målretting av CypD-genet, som spiller en viktig rolle i metabolismen av mitokondrier; EGFR, en nøkkelspiller i onkogen transformasjon; og Tp53, et sentralt gen i DNA-skaderespons. I tillegg til temporally og betinget kontrollert genredigering, er en annen fordel med metoden at stabiliseringen av DD-Cas9 er uavhengig av transkripsjonen. Denne funksjonen muliggjør samuttrykk, under samme promotor, av sporbare markører samt rekombinasjoner, for eksempel østrogenreseptoravhengig rekombininase, CRE^ER. I dette arbeidet viser vi hvordan vår metode kan brukes in vitro, til betinget mål for eksempel DNA-replikasjonsgen, RPA3.