使用有条件Cas9稳定评估基因功能的新工具包
Summary
在这里，我们描述了一个基因组编辑工具，基于时间和条件稳定聚类定期间歇性短腹膜重复（CRISPR-）相关蛋白质9（Cas9）下的小分子，盾牌-1。该方法可用于培养细胞和动物模型。
Abstract
聚类定期间歇性短回流（CRISPR-）相关蛋白质9（CRISPR/Cas9）技术已成为一种流行的实验室工具，在基因组中引入准确和有针对性的修饰。其巨大的受欢迎程度和快速的传播归因于其易于使用和准确性相比，其前身。然而，该系统的构成激活应用有限。在本文中，我们描述了一种新方法，允许基于Cas9蛋白质有条件稳定对CRISPR/Cas9活性进行时间控制。将拉帕霉素结合蛋白FKBP12的工程突变物与Cas9（DD-Cas9）融合，使Cas9迅速降解，而这种降解又可以通过存在FKBP12合成配体（盾牌-1）来稳定。与其他诱导方法不同，该系统可以很容易地适应生成双系统，以与另一个感兴趣的基因共同表达DD-Cas9，而无需对第二个基因进行有条件的调节。这种方法能够生成可追溯系统，以及Cas9核酸酶靶向的等位基因的平行、独立操作。该方法的平台可用于对基本基因进行系统识别和定性，并研究基因在体外和体内的功能相互作用。
Introduction
CRISPR-Cas9代表”定期间歇性短回流相关蛋白质9″，作为细菌自适应免疫1，2研究的一部分首次被发现。今天，CRISPR/Cas9已成为可编程基因编辑的最知名的工具，系统中不同的迭代已被开发，允许转录和表观遗传调制3。这项技术使DNA4的几乎任何序列都能够进行高度精确的基因操作。
任何CRISPR基因编辑的基本组成部分是一个可定制的指南RNA序列和Cas9核素5。RNA指南与DNA中的目标互补序列结合，指示Cas9核素在基因组3、4的特定点进行双链断裂。由此产生的部位然后修复由非同源端连接（ NHEJ ）或同源定向修复（ HDR ），随之而来的是目标 DNA 序列5的变化。
CRISPR/Cas9基于基因编辑是易于使用的，相对便宜相比，以前的基因编辑技术，它已被证明既有效又强大的多重系统2，4，5。然而，这个系统存在一些局限性。Cas9的构成表达经常被证明会导致偏离目标的数量增加和高细胞毒性4，6，7，8。此外，Cas9对基本和细胞生存基因的构成定位剥夺了其进行某些类型的功能研究的能力，如细胞死亡的动能研究。
已开发了不同的诱导或有条件控制的CRISPR-Cas9工具，以解决这些问题6，如泰特-ON和泰特-关闭9：特定地点重组10：化学诱导的接近11：因汀依赖拼接3：和4-羟基甲基雄激素受体（ER）为基础的核定位系统12。一般来说，这些程序（因汀拼接和化学诱导的接近分割系统）大多不提供可逆的控制，对药物治疗（Tet-On/Off系统）的动能反应非常缓慢，或不适合高通量操纵6。
为了解决这些限制，我们开发了一个新的工具包，不仅提供快速和强大的时间控制基因编辑，而且还确保可追溯性，可调和适应高吞吐量基因操作。这种新技术可用于细胞系、器官和动物模型。我们的系统基于一个工程领域，当融合到Cas9时，它会导致其快速退化。然而，它可以迅速稳定与高度选择性，无毒，细胞渗透的小分子。更具体地说，我们设计了人类FKBP12突变的”破坏稳定领域”（DD）到Cas9，标志着Cas9通过无处不在的蛋白体系统快速和构成退化时，在哺乳动物细胞13表达。DD合成配体，盾-1可以稳定DD构象，从而防止蛋白质的降解融合到DD（如Cas9）在一个非常有效的方式，并与快速动能反应14，15。值得注意的是，Shield-1与突变的FKBP12的强度比其野生型对应物14的强度要紧三个数量级。
DD-Cas9/Shield-1对可用于研究培养细胞和动物模型中基本基因的系统识别和表征，正如我们以前通过有条件地瞄准CypD基因所表明的那样，CypD基因在线粒体的新陈代谢中起着重要作用：EGFR，在致癌转化的关键角色;和Tp53，DNA损伤反应中的核心基因。除了时间和条件控制的基因编辑，该方法的另一个优点是DD-Cas9的稳定独立于其转录。此功能可在同一促进器下共同表达可追溯标记以及重组，如雌激素受体依赖重组酶、CREER。在这项研究中，我们展示了我们的方法如何在体外成功使用，以有条件地瞄准DNA复制基因，RPA3。
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9技术彻底改变了功能性地询问基因组2的能力。然而，基因的灭活往往导致细胞致死性、功能缺陷和发展缺陷，限制了这种研究基因功能的方法的效用。此外，Cas9 的构成表达可能导致毒性和产生偏离目标的影响6。已开发出不同的方法，以时间控制CRISPR-Cas9为基础的基因组编辑技术6。这些系统要么基于Cas9和/或sgRNA的转…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢我们的实验室前成员和科学家塞里夫·森图尔克以前的工作。我们感谢达尼洛·塞戈维亚批判性地阅读了这份手稿。这项研究是可能的，并得到了游泳横跨美国和国家癌症研究所癌症目标发现和发展中心计划的支持。
Materials
| 100mM DTT | Thermosfisher | ||
| 10X FastDigest buffer | Thermosfisher | B64 | |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | M0202S | |
| colorimetric BCA kit | Pierce | 23225 | |
| DMEM, high glucose, glutaMax | Thermo Fisher | 10566024 | |
| FastAP | Thermosfisher | EF0654 | |
| FastDigest BsmBI | Thermosfisher | FD0454 | |
| Flag [M2] mouse mAb | Sigma | F1804-50UG | |
| Genomic DNA extraction kit | Macherey Nagel | 740952.1 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| oligonucleotides | Sigma Aldrich | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polybrene | Sigma Aldrich | TR-1003-G | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit | Qiagen | 28506 | |
| secondary antibodies | LICOR | ||
| Shield-1 | Cheminpharma | ||
| Stbl3 competent bacterial cells | Thermofisher | C737303 | |
| SURVEYOR Mutation Detection Kit | Transgenomic/IDT | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273S | |
| α-tubulin [DM1A] mouse mAb | Millipore | CP06-100UG |
Referências
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