조건부 Cas9 안정화를 사용하여 유전자 기능을 평가하기 위한 새로운 툴킷
Summary
여기서, 우리는 소분자, Shield-1 하에서 정기적으로 간격이 있는 짧은 palindromic 반복-(CRISPR-) 관련 단백질 9 (Cas9)의 시간적 및 조건부 안정화에 기초하여 게놈 편집 도구를 기술합니다. 이 방법은 배양 된 세포 및 동물 모델에 사용될 수있다.
Abstract
클러스터된 짧은 palindromic 반복-(CRISPR-) 관련 단백질 9 (CRISPR/Cas9) 기술은 게놈에 있는 정확하고 표적으로 한 수정을 소개하는 널리 퍼진 실험실 공구가 되었습니다. 그것의 엄청난 인기와 급속한 확산은 그것의 전임자에 비해 그것의 쉬운 사용 및 정확성에 기인한다. 그러나 시스템의 구성 활성화는 제한된 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 이 논문에서는 Cas9 단백질의 조건부 안정화에 기초하여 CRISPR/Cas9 활성을 측두식할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 라파마이신 결합 단백질 FKBP12의 엔지니어링 된 돌연변이를 Cas9 (DD-Cas9)에 융합하면 FKBP12 합성 리간드 (Shield-1)의 존재에 의해 안정화 될 수있는 Cas9의 급속한 분해를 가능하게합니다. 다른 유도 가능한 방법과 는 달리, 이 시스템은 두 번째 유전자의 조건부 조절 없이 다른 관심사 유전자와 DD-Cas9를 공동 발현하기 위해 바이 시트론 시스템을 생성하도록 쉽게 적응할 수 있다. 이 방법은 Cas9 뉴클레아아아제에 의해 표적화된 항선의 병렬, 독립적인 조작뿐만 아니라 추적 가능한 시스템의 생성을 가능하게 한다. 이 방법의 플랫폼은 필수 유전자의 체계적인 식별 및 특성화 및 시험관 내 및 생체 내 환경에서 유전자의 기능적 상호 작용의 심문을 위해 사용될 수 있다.
Introduction
CRISPR-Cas9는“정기적으로 간격이 짧은 palindromic 반복 관련 단백질 9″을의미하는 CRISPR-Cas9는 세균 적응 면역1,2에대한 연구의 일환으로 처음 발견되었다. 오늘날 CRISPR/Cas9는 프로그래밍 가능한 유전자 편집을 위한 가장 인정받는 도구가 되었으며 시스템의 상이한 반복은 전사 및 후성 유전학 변조3을허용하도록 개발되었다. 이 기술은 DNA 4의 거의 모든 순서의 매우 정밀한 유전 조작을 가능하게합니다.
CRISPR 유전자 편집의 필수 성분은 사용자 지정 가능한 가이드 RNA 서열 및 Cas9 nuclease5이다. RNA 가이드는 DNA내의 표적-보완 서열에 결합하여 Cas9 뉴클레아아아제에게 게놈3,4의특정 지점에서 이중 가닥 브레이크를 수행하도록 지시한다. 그 결과 골짜기 부위는 비동종 최종 결합(NHEJ) 또는 상동성 지향 수리(HDR)에 의해 수리되며, 결과적으로 표적 DNA 서열5의변화가 도입된다.
CRISPR/Cas9 계 유전자 편집은 사용하기 쉽고, 이전 유전자 편집 기술에 비해 상대적으로 저렴하며, 시스템2,4,5의복합성에서 효율적이고 견고하다는 것이 입증되었다. 그러나 시스템은 몇 가지 제한을 제시합니다. Cas9의 구성 발현은 종종 오프 타겟의 증가 수와 높은 세포 독성4,6,7,8의증가를 초래하는 것으로 나타났다. 추가적으로, Cas9에 의하여 필수 및 세포 생존 유전자의 구성 적인 표적은 세포 사멸의 운동 연구 결과와 같은 기능적인 연구의 특정 모형을 능력을 멀리취합니다 7.
Tet-ON 및 Tet-Off9와같은 이러한문제를해결하기 위해 다른 유도성 또는 조건부 제어 CRISPR-Cas9 도구가 개발되었습니다. 사이트별 재조합10; 화학적으로 유도된근접성 11; 인테인 종속 접합3; 및 4-하이드록시타목시펜 에스트로겐 수용체(ER) 기반 핵 국소화시스템(12). 일반적으로, 이러한 절차의 대부분(인테인 접합 및 화학적으로 유도된 근접 분할 시스템)은 가역적 제어를 제공하지 않으며, 약물 치료에 매우 느린 운동 반응을 제시하거나(Tet-On/Off 시스템), 또는 고처리량 조작6에의존하지 않는다.
이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 빠르고 강력한 측두식 유전자 편집을 제공 할뿐만 아니라 추적성, 튜닝성 및 높은 처리량 유전자 조작에 대한 편의성을 보장하는 새로운 툴킷을 개발했습니다. 이 새로운 기술은 세포주, 오르가노이드 및 동물 모델에서 사용할 수 있습니다. 우리의 시스템은 Cas9에 융합 될 때 엔지니어링 된 도메인을 기반으로, 그것은 그것의 급속한 저하를 유도. 그러나, 고도로 선택적, 비독성, 세포 투과성 소분자로 빠르게 안정화될 수 있다. 보다 구체적으로, 인간 FKBP12 돌연변이 “불안정 도메인”(DD)을 Cas9로 설계하여, 포유류세포(13)에서발현될 때 유비퀴틴-프로테솜 시스템을 통해 신속하고 구성적인 분해를 위해 Cas9를 표시하였다. DD 합성 리간드, 쉴드-1은 DD 변형을 안정화시켜 DD(Cas9 와 같은)에 융합된 단백질의 분해를 매우 효율적인 방식으로, 그리고 빠른 운동반응(14,15)으로방지할 수 있다. 참고로 Shield-1은 야생형 대응14보다돌연변이 FKBP12에 3배 더 단단하게 결합합니다.
DD-Cas9/Shield-1 쌍은 이전에 미토콘드리아대사에 중요한 역할을 하는 CypD 유전자를 조건부 대상으로 한 것으로 이전에 보여준 바와 같이 배양 세포 및 동물 모델에서 필수 유전자의 체계적인 식별 및 특성화를 연구하는 데 사용될 수 있습니다. EGFR, 온코겐 변환의 핵심 플레이어; 및 Tp53, DNA 손상 반응에 있는 중앙 유전자. 시간적 및 조건부 제어 유전자 편집 외에도 DD-Cas9의 안정화가 전사와 무관하다는 것이 방법의 또 다른 장점이 있습니다. 이 기능은 에스트로겐 수용체 의존성 재조합, CRE ER과 같은 추적 가능한 마커뿐만 아니라 재조합의 동시 발현을 가능하게한다. 이 작품에서, 우리는 우리의 방법이 성공적으로 시험관 내에서 사용될 수있는 방법을 보여줍니다, 예를 들어 조건부 대상, DNA 복제 유전자, RPA3.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9 기술은 게놈2를기능적으로 심문하는 기능에 혁명을 일으켰습니다. 그러나, 유전자의 불활성화는 종종 세포 치사성, 기능적 적자 및 발달 결함을 초래하여 유전자 기능을 연구하기 위한 이러한 접근법의 유용성을 제한한다7. 또한, Cas9의 구성 발현은 독성 및 오프 타겟 효과6의생성을 초래할 수 있다. CRISPR-Cas9 기반 게놈 편집 기술<sup cl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 전작에 대한 우리의 실험실과 과학자 세리프 Senturk의 이전 구성원에게 감사드립니다. 우리는 비판적으로이 원고를 읽고 다닐로 세고비아 감사합니다. 이 연구는 가능하 고 미국 전역 수영과 국립 암 연구소 암 대상 발견 및 개발 센터 프로그램에 의해 지원.
Materials
| 100mM DTT | Thermosfisher | ||
| 10X FastDigest buffer | Thermosfisher | B64 | |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | M0202S | |
| colorimetric BCA kit | Pierce | 23225 | |
| DMEM, high glucose, glutaMax | Thermo Fisher | 10566024 | |
| FastAP | Thermosfisher | EF0654 | |
| FastDigest BsmBI | Thermosfisher | FD0454 | |
| Flag [M2] mouse mAb | Sigma | F1804-50UG | |
| Genomic DNA extraction kit | Macherey Nagel | 740952.1 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| oligonucleotides | Sigma Aldrich | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polybrene | Sigma Aldrich | TR-1003-G | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit | Qiagen | 28506 | |
| secondary antibodies | LICOR | ||
| Shield-1 | Cheminpharma | ||
| Stbl3 competent bacterial cells | Thermofisher | C737303 | |
| SURVEYOR Mutation Detection Kit | Transgenomic/IDT | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273S | |
| α-tubulin [DM1A] mouse mAb | Millipore | CP06-100UG |
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