量化金黄色葡萄球菌对人多态核白细胞的细胞毒性

健康献血者从肝素静脉血收集根据蒙大拿州立大学人体学科机构审查委员会批准的协议。所有捐助者均表示同意参加本研究。 1. 人类多态核白细胞的纯化和人血清的分离 注：所有试剂均应使用市售内毒素检测试剂盒定期检查内毒素是否存在，并应含有<25.0 pg/mL内毒素，以防止PMN产生不必要的启动。 携带 50 mL 的 3% dextran-0.9% NaCl （w/v），35 mL 的 0.9% NaCl （w/v），20 mL 的 1.8% NaCl （w/v），12 mL 的 1.077 g/mL 密度梯度溶液，以及 20 mL 的注水或灌溉级水到室温。 为了分离人血清，在15 mL玻璃管中37°C下孵育4 mL新鲜抽取的人体血液，无需抗凝血剂30分钟。孵育后，在室温下以2，000~3，000 μg为10分钟。将上血清层转移到新鲜的15 mL圆锥形离心管中，并放在冰上。 将25 mL的新鲜提取的肝素化（1000单位/mL）全人血与25 mL的室温3xtran-0.9%NaCl（1：1比例）结合在两个复制50 mL锥形离心管（每管50 mL总体积）。通过轻轻摇动每个 50 mL 锥形管进行混合，然后在室温下站立 30 分钟。 在室温下孵育后，会出现两个独立的层。将每个 dextran-血混合物的顶层转移到新的 50 mL 锥形管中，并在室温下以 450 x g离心 10 分钟，且无制动器。 小心吸出上生子并丢弃，而不会干扰细胞颗粒。在室温为0.9%NaCl的2 mL中轻轻重新悬浮每个细胞颗粒，将重新悬浮的颗粒组合在一个50 mL锥形管中，然后加入剩余的0.9%NaCl（最终体积为35 mL）。 使用手移液器在细胞悬浮液下方小心地将10 mL的室温1.077 g/mL密度梯度溶液覆盖。在室温下，在低或无制动器下以 450 x g旋转 30 分钟。轻轻吸出上清液，而不会干扰细胞颗粒。上清液将含有外周血单核细胞，可以收集如前所述14。 通过在室温水中20 mL中重新悬浮细胞颗粒来使红血球赖尔。轻轻混合通过摇动管30s。红血球的流化将伴随着浊度的明显下降。 立即加入20 mL的1.8%NaCl（在室温[RT]）和离心机样品在450 μg在室温10分钟。注： 在红细胞裂洛后，尽量减少PMN单独留在水中的时间，以最大限度地提高PMN产量并防止PMN裂化和/或激活，这一点很重要。 小心吸出上清液，而不会干扰细胞颗粒。轻轻将细胞颗粒重新悬浮在 2 mL 的 RT RPMI 1640 介质中，并放置在冰上。 使用血细胞计对细胞进行计数。用冰冷的RPMI将纯化PMN以1 x107细胞/mL的浓度重新悬浮，并保持在冰上。 将 100 μL 的纯化 PMN（1 x 106细胞）与 300 μL 的冰冷 Dulbeco 的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 结合在两个复制的流式细胞测定管中，含有 1 μL 的碘化钠染色。为了对血浆膜损伤进行正控制，将40μL的0.5%Triton X-100溶液加入流式细胞测定管中，并彻底混合。 使用流式细胞测量测量纯化细胞的正向散射、侧散射和碘化钠染色（激励/排放最大值为535/617 nm）的纯化细胞（图1）。注：正向和侧散射分析将识别淋巴细胞和单核细胞的不需要种群。碘化钠只会染色具有受损血浆膜和纯化PMN的细胞，这些PMN具有明显的碘化钠阳性细胞群，不应使用。对于这些研究，纯化PMN仅在其包括>98%的纯化细胞和<5%染色阳性碘化钠时才使用。 通过涂覆用于此测定的 100 μL 的 20% 分离的人类血清（已用 DPBS 稀释）的单个孔，为 PMN 细胞毒性测定准备 96 孔板。注：直接在塑料或玻璃上电镀PMN会导致细胞激活。确保至少包括一个仅接收介质的负控制井和接收 0.05% Triton X-100 的正控制井。 在37°C下孵育板30分钟。孵育后，用冰冷的DPBS清洗涂膜孔两次，以去除任何多余的血清。轻轻按上下颠倒的盘子，取出任何残留的 DPBS 并放置在冰上。 在每个涂层井（1 x 106 PMN/井）中，以1 x 107细胞/mL轻轻添加100 μL纯化的人体PMN。通过在冰上孵育板至少5分钟，让PMN在井中沉淀，保持板的水平，使每个井中的细胞均匀分布，并留在冰上，以避免PMN的意外激活。 2. 对人多态核白细胞的S.aureus细胞外蛋白的细胞毒性测定 培养性 S. aureus在锥体大豆汤 （TSB） 中使用 37°C 的摇动培养箱过夜。对于这些研究，在单独的 150 mL Erlenmeyer 烧瓶中，20 mL TSB 接种了S. aureus菌株 USA300 或 USA300+saeR/S的冷冻培养物，生长约 14 小时，在 250 rpm 下摇动。 亚培养S. aureus通过使用新鲜介质对隔夜细菌培养进行 1：100 稀释。在37°C下孵育，摇动，直到细菌达到早期静止生长阶段。注：对于这些实验，在150 mL Erlenmeyer 烧瓶中接种200 μL 隔夜培养的 USA300 或 USA300°saeR/S的 20 mL 试青大豆汤，并在 37°C 下孵育，在 250 rpm 下摇动 5 小时。 当细菌达到早期固定生长阶段时，将1 mL的亚培养的S.氨胶转移到1.5 mL微离心管中，并在室温下以5000 μ g离心5分钟。 离心后，将上清液转移到3mL注射器中。将超生物通过 0.22 μm 过滤器，进入冰上新的 1.5 mL 微离心管。 使用用于培养S. aureus的冰冷的介质对超生物进行连续稀释。注：对于所示的实验，来自美国300和USA300+saeR/S的超生物连续进行了四次1/2对数稀释与冰冷的TSB。 从步骤 1.15 起，将仅将上清样品或介质轻轻添加到 96 孔板上含有 PMN 的 96 孔板的单个孔中（用于负和正控制）。对于这些实验，将10μL的USA300或USA300°saeR/S上清样品添加到每个井中。轻轻的岩板在井中分配上生物，并在37°C下孵育。 在所需时间，从培养箱中取出盘子，放在冰上。将 40 μL 的 0.5% Triton X-100 添加到正控制井中。 轻轻地将样品上下移移到每口孔中，以完全拉出所有附着在板上的PMN，然后将样品转移到冰面上流式细胞测定管，其中含有300 μL的冰冷DPBS，含有1μL的碘化钠。 使用流动细胞测定测量碘化钠阳性PMN的比例（图2A）。当与DNA结合时，碘化钠在535/617nm处有激发/发射。 3. 在噬菌体后，对人多态核白细胞的Aureus细胞毒性测定 注：生长曲线由600nm（OD600）的光学密度和细菌浓度所定义，在开始此测定之前，必须根据经验确定要测试的S.aureus菌株。这些实验的成功要求使用亚培养细菌的OD600在指数中生长阶段测试的每种A.aureus菌株的浓度一致。 如步骤 2.1.1 和 2.1.2 中所述，开始一夜之间培养S. aureus菌株和亚培养细菌。 在达到中指数增长时，通过将培养细菌的 1 mL 转移到 1.5 mL 微离心管并在室温下在 5，000 μ g下离心 5 分钟，收获亚培养的 S. aureus。注：在我们的生长条件下，USA300和USA300+saeR/S在大约135分钟的孵育6后达到中指数增长阶段。 离心后通过吸气上清液、在 DPBS 的 1 mL 中重新悬浮颗粒细菌、将样品涡旋 30 s 和在室温下在 5，000 μ g下离心 5 分钟来洗涤S. aureus。 将用DPBS稀释的1mL的20%人血清中重新悬浮细菌颗粒，并在37°C下用搅拌孵育15分钟。将S.aureus重新悬浮在1mL中。 在室温下，在5，000 x g下将离心菌化5分钟。在离心后通过吸气上清液，将颗粒细菌重新悬浮在1 mL DPBS中，然后涡旋样品，直到细菌颗粒完全破碎，再加30秒，洗净了Aureus。在室温下，在5，000~g下离心细菌5分钟。 在1mL RPMI中重新悬浮成蛋白酶菌株，涡旋样品，直到细菌颗粒完全破碎，然后再将细菌放在冰上30s。 用冰冷的RPMI稀释蛋白酶菌株至所需浓度。涡旋30s，并放置在冰上。 通过在胰胶大豆琼脂上电镀1：10连续稀释细菌，确认蛋白石S.金黄色葡萄球菌的浓度。注：由于此测定中使用的细菌浓度差异会对随后的PMN血浆膜渗透性产生重大影响（图3A），因此，每个实验的菌株浓度确定，并且菌株之间具有等效性，这一点非常重要。 从步骤 1.14 开始，在 96 孔板上的 PMN 中，将每个S. 铝菌株或 RPMI（用于正负控制）的 100 μL/孔轻轻添加。轻轻地摇动石板，在井中分配S. 金黄色葡萄球。 在4°C15下，在500 μ g下离心板8分钟，同步方位细胞化。离心后在37°C下孵育板（T = 0）。 在所需时间，从培养箱中取出板并放置在冰上。将 40 μL 的 0.5% Triton X-100 添加到正控制井中。 轻轻地将样品上下移移到每个孔中，以完全拉出所有附着在板上的PMN，然后将样品转移到含有200 μL的冰冷DPBS的冰上，用1μL的碘化钠流动细胞学管。 使用流式细胞测定法分析碘化钠染色的样品，如步骤 2.9 中所述。