Inducción de eritosis en glóbulos rojos utilizando un ionoforo de calcio

La muerte celular programada en eritrocitos, también conocida como eritosis, es común en muchas condiciones clínicas y trastornos hematológicos. La eritosis se asocia con la contracción celular y la pérdida de asimetría fosfolípido en la membrana plasmática celular^1,2. La pérdida de asimetría resulta en la translocación de fosfatidilserina (PS), un lípido normalmente localizado en el prospecto interno^3,4, al prospecto externo celular, que indica a los macrófagos a la fagocitosa y eliminar eritrocitos defectuosos⁵,^6,7,8. Al final de la vida útil normal de los eritrocitos, la eliminación de células eriptóticas por macrófagos asegura el equilibrio de los eritrocitos en circulación. Sin embargo, en condiciones enfermas, como la enfermedad de las células falciformes y la talasemia^9,10,11, eritosis mejorada puede resultar en anemia grave². Debido a su importancia en las enfermedades hematológicas, existe un interés significativo en examinar los factores que inducen o inhiben la eritosis y los mecanismos moleculares subyacentes a este proceso.

La membrana plasmática de eritrocitos sanos es asimétrica, con diferentes fosfolípidos localizando en los foliolos externos e internos. La asimetría de la membrana se regula principalmente por la acción de las enzimas de membrana. El translocase de aminofosfolípidos facilita el transporte de aminofosfolípidos, PS y fosfatidiletanolamina (PE), dirigiendo estos lípidos al prospecto interno celular. Por otro lado, floppase transporta la colina que contiene fosfolípidos, fosfatidilcolina (PC) y esfingomielina (SM), desde el interior hasta el foliolo exterior de la membrana celular¹². Sin embargo, a diferencia de las células sanas, la membrana de los eritrocitos erifóticos está revuelta. Esto se debe a la acción de una tercera enzima, la escramblasa, que interrumpe la asimetría fosfolípido facilitando el transporte bidireccional de los aminofosfolípidos^13,14,15,16. Scramblase se activa por niveles intracelulares elevados de Ca^2+. Por lo tanto, los ionoforos de calcio, que facilitan el transporte de Ca²⁺ a través de la membrana celular^12,son inductores eficientes de la eriptosis.

La ionomicina, un ionóforo de calcio, ha sido ampliamente utilizada para inducir la eritosis en eritrocitos^{12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26}. La ionomicina tiene grupos hidrófilos e hidrófobos, que son necesarios para unir y capturar el ion Ca^2+, y transportarlo al espacio citosólico^27,28,29. Esto conduce a la activación de la scramblasa y la translocación de PS al prospecto exterior, que se puede detectar fácilmente utilizando annexin-V, una proteína celular con una alta afinidad a PS^12. Aunque la activación de la eritosis por ionomicina se divulga comúnmente, hay una considerable discrepancia de método en la literatura (Tabla 1). La población de eritrocitos sometidos a eriptosis depende de diferentes factores como la concentración de ionóforos, el tiempo de tratamiento con ionóforo y el contenido de azúcar del entorno extracelular (el agotamiento de la glucosa activa los canales catiónicos y facilita la entrada de Ca²⁺ en el espacio citosólico)^30,31. Sin embargo, hay poca consistencia en estos factores en la literatura, lo que dificulta la realización de eritosis reproduciblemente in vitro.

En este protocolo, presentamos un procedimiento paso a paso para inducir la eritosis en eritrocitos humanos. Se examinan los factores que afectan a la eriptosis exitosa, como la concentración de Ca^2+, la concentración de ionoforres, el tiempo de tratamiento y la preincubación en el tampón agotado de glucosa y se notifican valores óptimos. Este procedimiento demuestra que la preincubación de eritrocitos en un tampón libre de glucosa aumenta significativamente el porcentaje de eritosis en comparación con el tampón que contiene glucosa. Este protocolo se puede utilizar en el laboratorio para producir eritrocitos eriptóticos para diversas aplicaciones.