固体肿瘤的预测免疫建模

此处所示的代表性结果中使用的人体组织样本是从信誉良好的实体（三星技术集团）购买的，并告知捐赠者同意，允许学术和商业研究，并经合格道德人批准委员会。 第一部分：预捕获库准备 1. RNA定量和资格鉴定 使用荧光测定对RNA进行定量，以确定测定的相应输入。使用电泳评估评估输入RNA的质量，以确定RNA完整性数（RIN）和片段百分比>200核苷酸（DV200）值。 对于完整 （RIN > 7） 或部分降解的 RNA 样本 （RIN = 2 到 7），请遵循从步骤 2.1 开始的高质量/完整 RNA 的库准备步骤。RNA的质量对于选择热循环程序#1正确的破碎时间非常重要（补充表2）。 对于高度降解的样品（例如，RIN = 1 到 2 或 FFPE），确定 DV200值。这些样品不需要碎裂，并将遵循降解RNA的指令，从步骤2.2开始。 通过稀释 20 ng RNA（具有 RIN > 2 的高质量/可处理 RNA）或 40 ng RNA（具有 DV200 > 20% 的降解/FFPE RNA），为每个样品制备适当的总RNA总量在无核酸酶水中至5μL。不建议使用 DV200 < 20% 处理样品。对于随试剂盒提供的对照RNA样品，在4μL无核酸酶水中稀释1μL的相应RNA。控制样品将按照与描述的高质量（完好）或降解（FFPE）RNA材料相同的处理，如标签。有关试剂盒中包含的所有试剂，请参阅补充表 1。 2. RNA碎片和起起 遵循步骤 2.1.1，使用 RIN > 2 的高质量/可操作 RNA。 对于高质量的RNA，根据表1，在无核酸酶PCR管中组装冰上破碎和充注反应。 通过上下多次移液彻底混合。然后，在微离心机中短暂旋转样品注：对于协议中的所有离心机旋转，建议至少 3 s 的速度为 ± 1，000 x g。 将样品放入热循环仪中，使用程序#1（补充表2）。 立即将管转移到冰上，然后进行第一股cDNA合成，以进行高质量的RNA（步骤3.1）。为了同时制备高质量和FFPERNA，在碎片孵育期间开始制备FFPERNA（步骤2.2）。 碎片和启动混合 体积 （μL） 完整或部分降解的RNA （20 ng） 5 第一股合成反应缓冲液 4 随机引醚 1 总容量 10 表1：高质量RNA的破碎和启动反应。高质量RNA的破碎和充注反应的成分应根据所示体积在冰上组装和混合。可以制作第一股合成反应缓冲液和随机引物的主混合物，并将其添加到RNA样品中。 对于具有 DV200 > 20% 的降级/FFPE RNA，请执行步骤 2.2.1。 对于不需要碎片的高度降解 （FFPE） RNA，如表 2所述组装起吸反应。对于完整的RNA，请记住遵循步骤2.1。 通过上下多次移液彻底混合。然后，在微离心机中短暂旋转样品。 将样品放入热循环仪中并使用程序#2（补充表 2）。 将管转移到冰上，然后进行高降解（FFPE）RNA的第一股cDNA合成（步骤3.2）。 刺激反应 体积 （μL） FFPE RNA （40 ng） 5 随机引醚 1 总容量 6 表2：高降解RNA的随机充注反应。高降解RNA的充注反应的成分应组装在无核酸酶PCR管的冰上。 3. 第一股cDNA合成 遵循步骤 3.1.1，使用 RIN > 2 的高质量/可操作 RNA。 对于完整的RNA（高质量），根据表3，在无核酸酶PCR管中组装冰上的第一股合成反应。 保持在冰上的反应，彻底混合通过移液向上和向下几次。在微离心机中短暂旋转样品，然后直接进入第一股合成孵育（步骤4）。 第一股合成 体积 （μL） 碎片和原始RNA（步骤2.1.3） 10 第一链合成特异性试剂 8 第一链合成酶混合物 2 总容量 20 表3：优质RNA的第一股合成反应。高质量RNA的破碎和充注反应的成分应根据给出的体积在冰上组装和混合。可以制作第一股合成特异性试剂和第一链合成酶混合物的主混合物，并将其添加到碎裂和填充RNA样品中。 对于具有 DV200 > 20% 的降级/FFPE RNA，请执行步骤 3.2.1。 对于高降解RNA（FFPE），根据表4，在无核酸酶PCR管中组装冰上的第一股合成反应。 保持在冰上的反应，彻底混合通过移液向上和向下几次。在微离心机中短暂旋转样品，然后直接进入第一股合成孵育（步骤4）。 第一股合成 体积 （μL） 引核糖核酸（步骤2.2.3） 6 第一股合成反应缓冲液 4 第一股特异性试剂 8 第一链合成酶混合物 2 总容量 20 表4：高降解RNA的第一股合成反应。高降解RNA的破碎和充注反应的成分应根据所示体积在冰上组装和混合。可以制作第一股合成反应缓冲液、第一股合成特异性试剂和第一链合成酶混合物的主混合物，并将其添加到填充RNA样品中。 4. 第一股合成孵化 保持管子在冰上，通过上下移液多次彻底混合。在微离心机中短暂旋转样品。按照计划#3（补充表2），在预热的热循环器中孵育样品。 5. 第二股cDNA合成 通过组装表5所列成分，包括步骤4.1中的第一股反应产物，在冰上制备第二股cDNA合成反应。 第二股合成反应 体积 （μL） 第一链合成产品（步骤 4.1） 20 第二股合成反应缓冲液 8 第二股合成酶混合物 4 无核酸酶水 48 总容量 80 表5：第二股合成反应。第二股cDNA合成反应的成分应根据所示体积在冰上组装和混合。可以制作第二股合成反应缓冲液、第二股合成酶混合物和无核酸酶水的主混合物，并将其添加到第一链合成产品中。 保持管子在冰上，通过上下移液多次彻底混合。按照计划#4（补充表2）在热循环器中孵育。 6. 使用 SPRI（固体相位可逆固定）珠进行 cDNA 清理 在使用前，让 SPRI 珠加热至室温至少 30 分钟，然后涡旋 SPRI 珠约 30 秒重新悬浮。 将144 μL的再悬浮珠子加入第二股合成反应（±80 μL）。通过上下移液至少10次，在室温下孵育5分钟，将混合良好。 在微离心机中短暂旋转管，并将管放在磁性机架上，将珠子与上清液分离。溶液清除后，小心地取出并丢弃上清液。小心不要打扰含有DNA的珠子。 在磁性机架上将 180 μL 新鲜制备的 80% 乙醇添加到管中。在室温下孵育30s，然后小心地取出并丢弃上清液。 重复步骤 6.4 一次，共执行 2 个洗涤步骤。 完全去除残留乙醇。将管子留在磁性机架上，在盖子打开时将磁珠干燥约 3 分钟，或直到明显干燥。不要过度干燥珠子，因为这可能导致DNA的恢复性降低。 从磁铁中取出管子，向磁珠中加入 53 μL 0.1x TE 缓冲液（包含在试剂盒中，参见补充表 1）。上下移液至少10次，彻底混合。在室温下孵育2分钟。 将管子放在磁性机架上，使磁珠与上清液完全分离。转移50μL的上清液，以清洁无核酸酶PCR管。小心不要打扰珠子。这是协议中的一个可选停止点，cDNA样品可储存在-20°C。 7. cDNA库的终端修复 将表 6中列出的组件装配到步骤 6.8 中的第二股合成产物，从而在冰上组装端部修复反应。 端修复反应 体积 （μL） 第二股合成产物（步骤 6.8） 50 端修复反应缓冲液 7 端修复酶混合 3 总容量 60 表 6：结束修复反应。端部修复反应的部件应根据所示体积在冰上组装和混合。可以制作端部修复反应缓冲液和端部修复酶混合物的主组合，并将其添加到第二股合成产品中。 将移液器设置为 50 μL，然后将整个音量向上和向下移移至少 10 次，以便彻底混合。短暂离心机，从管侧收集所有液体。搞好组合很重要。存在少量气泡不会影响性能。 按照计划#5（补充表2），在热循环器中孵育样品。 8. 适配器连接 在设置结扎反应之前，在冰冷的适配器稀释液中稀释适配器，如表7所示，乘以所需数量的样品，加上10%的额外量。将稀释的适配器放在冰上。 结扎稀释 体积 （μL） 适配器 0.5 适配器稀释缓冲器 2 总容量 2.5 表7：适配器稀释。适配器应在冰上稀释，并根据所示体积使用适配器稀释缓冲液。 将表8中所述的成分按列出的顺序添加到步骤7.3的末端制备反应产物中，从而组装冰上结扎反应。请注意，可提前混合配型主混合和配合增强剂。这种混合物在4°C下稳定至少8小时。在适配器结扎步骤中使用之前，请勿预混合结扎主混合、结扎增强剂和适配器。 结扎反应 体积 （μL） 结束预置DNA（步骤 7.3） 60 稀释适配器（步骤 8.1） 2.5 结扎增强剂 1 结扎主混合 30 总容量 93.5 表8：结扎反应。适配器结扎反应的成分应按照所示顺序显示的体积在冰上组装。可以制作结扎增强剂和结扎主混合的主组合，并将其添加到带有稀释适配器的末端预置 DNA 中。在与末端预置DNA混合之前，请勿混合稀释的适配器和结扎主混合或结扎增强剂。 将移液器设置为 80 μL，然后将整个音量向上和向下移移至少 10 次，以便彻底混合。执行快速旋转，从管侧收集所有液体。结扎主混合是非常粘稠的。注意确保结扎反应的充分混合，因为不完全混合会导致连接效率降低。存在少量气泡不会影响性能。 按照程序#6孵育（补充表2），然后从热循环器中取出结扎混合物，加入3μL的适配器处理酶，导致总体积为96.5μL。 上下移液几次混合好，然后孵育遵循程序#7（补充表2），然后立即着手净化结扎反应。 9. 使用SPRI奈德净化结扎反应 在使用前，让 SPRI 珠加热至室温至少 30 分钟，然后涡旋 SPRI 珠约 30 秒重新悬浮。 加入87 μL的重新悬浮的SPRI珠，通过上下移液至少10次，混合良好。在室温下孵育10分钟。 在微离心机中短暂旋转管，并将管放在磁性机架上，将珠子与上清液分离。溶液清除后（±5分钟），小心地取出并丢弃上清液。不要丢弃珠子。 在磁性机架上将 180 μL 新鲜制备的 80% 乙醇添加到管中。在室温下孵育30s，然后小心地取出并丢弃上清液。重复步骤 9.4 一次，共执行 2 个洗涤步骤。 完全去除残留乙醇。将管子留在磁性机架上，在盖子打开时将磁珠干燥约 3 分钟，或直到明显干燥。不要过度干燥珠子，因为这可能导致DNA的恢复性降低。 从磁体中取出管，向磁珠中加入 17 μL 的 0.1x TE 缓冲液。上下移液至少10次，彻底混合。在室温下孵育2分钟，然后将管子放在磁性架上，使珠子与上清液完全分离。 转移15μL的上清液，以清洁无核酸酶PCR管。小心不要打扰珠子。这是协议中的一个可选停止点，适配器连结的DNA可以储存在-20°C。 10. 适应剂扩能DNA的PCR浓缩 如表9所述设置PCR反应。包含预捕获 PCR 主混合物和通用底漆的主组合可以制成并添加到适配器连体 DNA 中。对于多路复用测序，为每个反应使用唯一的索引引出，并分别添加到每个样本中。 PCR 浓缩 体积 （μL） 适配器连结DNA（步骤10.1） 15 预捕获 PCR 主混合 25 通用 PCR 底漆 5 索引 （X） 引信 5 总容量 50 表9：适配器结扎DNA的PCR富集。适配器连结DNA反应的PCR富集的成分应根据所示体积在冰上组装和混合。预捕获 PCR 主混合物和通用 PCR 底漆的主组合可以制成并添加到适配器连体 DNA 中。对于多路复用排序，应为每个样本指定一个唯一的索引引信。 轻轻上下移液10次，搅拌均匀。在微离心机中短暂旋转管并放置在热循环器中，并使用程序#8执行 PCR 扩增（补充表 2）。 11. 使用SPRI珠净化PCR反应 在使用前，让 SPRI 珠加热至室温至少 30 分钟，然后涡旋 SPRI 珠约 30 秒重新悬浮。 在每个PCR反应中加入45μL的再悬浮珠子（±50 μL）。在室温下孵育5分钟之前，通过上下移液至少10次，将混合良好。 在微离心机中短暂旋转管，并将管放在磁性机架上，将珠子与上清液分离。溶液清除后（±5分钟），小心地取出并丢弃上清液。小心不要打扰含有DNA的珠子。 在磁性机架中向管中加入 180 μL 新鲜制备的 80% 乙醇。在室温下孵育30s，然后小心地取出并丢弃上清液。重复步骤 11.4 一次，共执行 2 个洗涤步骤。 完全去除残留乙醇。将管子留在磁性机架上，在盖子打开时将磁珠干燥约 3 分钟，或直到明显干燥。不要过度干燥珠子，因为这可能导致DNA的恢复性降低。 从磁铁上取下管子，向磁珠中加入 23 μL 0.1x TE 缓冲液。上下移液至少10次，彻底混合。在室温下孵育2分钟。 将管子放在磁性机架上，使磁珠与上清液完全分离。转移20μL的上清液，以清洁无核酸酶PCR管。小心不要打扰珠子。这是协议中的一个可选停止点，预捕获库可能存储在 -20°C。 12. 验证和量化预捕获库 使用荧光计和高灵敏度测定试剂盒测量预捕获库的浓度。进行第二部分：杂交和捕获，最低产量为 200 纳克。 在数字电泳系统上运行 1 μL 库。如有必要，根据制造商的协议建议，稀释样品以避免高灵敏度芯片过载。 检查电图显示的峰值尺寸约为 250-400 bp 的窄分布（参见代表性结果，图 3和图 4）。 如果生物分析仪曲线中可见 128 bp 峰值（适配器-二聚体），并且信号强度为 ± 250-400 bp 库信号强度（参见代表性结果，图 5），然后使用 0.1x TE 缓冲液将样本体积（从步骤 11.7）调高至 50 μL，并重复 SPRI 珠化纯化（步骤 11）。这是协议中的一个可选停止点，预捕获库可能存储在 -20°C，然后再进入第二部分：免疫普杂和捕获。 第二部分：杂交和捕获 13. 结合阻断奥利果斯、Cot-1 DNA、预捕获库DNA和干燥 将步骤 11 中准备的条形码库与无核酸酶 PCR 管或 1.5 mL 微管中的 Cot-1 DNA 和阻断 Oligos 混合，如表 10所示。 试剂 数量/数量 步骤 10.10 的条形码库 200 纳克 婴儿床-1 DNA 2 μg 阻止奥利戈斯 2 μL 表10：杂交制备和干燥。在制备杂交时，用于干燥库的组件应根据显示的数量进行组装。 使用设置为 30-45 °C 的真空集中器干燥管内的物品。这是协议中的可选停止点。干燥后，管子可在室温（15-25°C）下过夜，或在-20°C下储存更长时间。 14. 将DNA捕获探针与库杂交 解冻 2x 珠洗液缓冲液和杂交缓冲液、杂交缓冲液增强剂、免疫循环探针面板、10x 洗涤缓冲液 1、10x 洗涤缓冲液 2、10x 洗涤缓冲液 3 和 10x 严格洗涤缓冲液室。使用前，检查混合缓冲液是否有盐的结晶。如果存在晶体，在 65°C 加热管，间歇性地晃动，直到缓冲液完全溶解。 在室温下，在管中创建杂交主混合物。将卷乘以样本数，并额外添加 10%，如下表 11。 杂交主混合 体积 （μL） 杂交缓冲器 8.5 杂交缓冲器增强剂 2.7 免疫普瑞普学探针面板 5 无核酸水 0.8 总容量 17 表 11：混合主混合。杂交主混合组件应根据所示体积在室温下组装和混合。 涡旋或移液器上下混合良好。然后，将17μL的杂交主混合物加入每个含有干燥DNA的管中。密封管并在室温下孵育5分钟。 涡旋样品，确保它们完全混合，并在微离心机中短暂旋转样品。如果适用，将每个样品从 1.5 mL 微管转移到无核酸酶 PCR 管中。 将样品放入热循环仪中，并运行程序#9（补充表 2）。 在孵育期间，准备洗涤缓冲液（步骤15）和链球菌球珠（步骤16），留出足够的时间预热缓冲液并平衡链球菌球珠。 15. 准备洗涤缓冲器 注：洗涤缓冲液作为2x（珠洗缓冲液）或10x（所有其他洗涤缓冲液）浓缩溶液提供。 在杂交孵育期间，稀释2x珠洗液缓冲液和10x洗涤缓冲液，以创建1倍的工作溶液，乘以所需数量的样品，并额外增加10%，如下表12。如果 10x 洗涤缓冲液 1 为多云，则在 65°C 的水浴或加热块中加热瓶子以重新悬浮颗粒。冷冻1x洗涤缓冲液应在解冻后混合。 清洗缓冲器 浓缩缓冲液 （μL） 无核酸酶水 （μL） 总计 （μL） 珠洗缓冲液 150 150 300 清洗缓冲液 1 25 225 250 清洗缓冲液 2 15 135 150 清洗缓冲液 3 15 135 150 严格的洗涤缓冲液 30 270 300 表12：清洗缓冲稀释。根据所示体积，在室温下，应用无核酸酶水稀释浓缩洗涤缓冲液。 将1x洗涤缓冲液与无核酸酶PCR管中相及，并置于表13所示的适当温度下。确保有足够的超龄移液。对于加热缓冲液，使用设置为 65°C 的热循环器，盖子设置为 70°C。 清洗缓冲器 保持温度 体积/管 （μL） 管数/样本数 珠洗缓冲液 RT （15-25 °C） 100 3 清洗缓冲液 1 65 °C 100 1 清洗缓冲液 1 RT （15-25 °C） 150 1 清洗缓冲液 2 RT （15-25 °C） 150 1 清洗缓冲液 3 RT （15-25 °C） 150 1 严格的洗涤缓冲液 65 °C 150 2 表13：稀释洗涤缓冲液。稀释的洗涤缓冲液应根据显示的每个样品的体积和试管数量，将同点引入单独的管中。使用前，清洗缓冲液必须保持在指示温度。 如表14所示，在室温下制备珠重新悬浮混合物，乘以所需样本数，再加10%。 珠重新悬浮混合 体积 （μL） 杂交缓冲器 8.5 杂交缓冲器增强剂 2.7 无核酸水 5.8 总容量 17 表14：珠重新悬浮混合。根据所示体积，应在室温下组装和混合珠重新悬浮混合物的部件。 16. 准备链球菌珠 在室温下平衡链球菌珠，在使用前至少30分钟。通过涡旋15s和等分50μL的珠子，将珠子彻底混合到无核酸酶PCR管中。 在每个管中加入 100 μL 的 1x 珠洗液缓冲液（步骤 15.1 中准备）。轻轻上下移液10次混合。将管子放在磁性机架上，使磁珠与上清液完全分离。 拆下并丢弃清除的上清液。小心不要打扰珠子。 执行以下洗涤。 从磁性机架上拆下。将100 μL的1x珠洗液缓冲液加入每个含有珠子的管中，然后上下移液10次混合。 将管子放在磁性机架中，使磁珠与上清液完全分离。 小心地取出并丢弃清除的上清液。 重复步骤 16.4 一次，共两次。 从磁性机架上拆下。从步骤 15.3 向每个管中添加 17 μL 的珠重悬浮混合物。上下移液几次彻底混合。确保珠子没有卡在管的侧面。如果需要，短暂地旋转管子以收集底部的珠子。 17. 将杂交靶与链球菌珠结合 完成 4 小时杂交孵育后，从热循环器中取出样品，并将热循环器设置为 65°C 孵育，加热盖设置为 70°C。 使用多通道移液器，将 17 μL 完全均质珠转移到样品。通过上下移液10次彻底混合。 将DNA与珠子结合，按照程序#10（补充表2）将管子放入热循环器中。在孵育过程中，每隔10-12分钟短暂取出带状管，轻轻涡旋3秒，以确保珠子保持悬浮状态。或者，通过上下移液多次混合。立即前往洗涤链球菌珠（步骤 18）。 18. 清洗链球菌珠去除未结合的DNA 使用步骤 15.2 中的 1x 洗涤缓冲液，并在洗涤过程中将加热缓冲液存放在热循环器中。 从步骤 17.3 向管中添加 100 μL 预热的 1x 洗涤缓冲液 1。通过上下移液10次彻底混合。将管子放在磁性机架上，使磁珠与上清液完全分离。 移液器并丢弃上清液，它含有未绑定的DNA。从磁性机架上拆下。 执行以下 65°C 洗涤。 加入150 μL的预热1x严格洗涤缓冲液。 通过上下移液至少10次彻底混合。在移液过程中避免气泡。确保所有管中都完全重新悬浮珠子。 在 65°C 的热循环器中孵育 5 分钟。 将管子放在磁性机架上，使磁珠与上清液完全分离。移液器并丢弃上清液，它含有未绑定的DNA。从磁性机架上拆下。 重复步骤 18.4，总共两次严格扫描。 执行第一次室温洗。 加入150 μL室温1x洗涤缓冲液1。 上下移移 10 到 20 次，以完全重新悬浮珠子。 密封管并孵育2分钟，在轻轻涡旋30秒和休息30秒之间交替。确保所有井中的珠子在整个孵育过程中在所有管中完全悬浮。 短暂地使管离心。 将管子放在磁性机架上，使磁珠与上清液完全分离。移液并丢弃上清液。 密封管并短暂离心。返回磁性机架并使用 10 μl 移液器去除任何残留洗涤缓冲液。 执行第二个室温洗。 加入150μL的室温1x洗涤缓冲液2。 上下移移 10 到 20 次，以完全重新悬浮珠子。 密封管并孵育2分钟，在轻轻涡旋30秒和休息30秒之间交替。确保所有井中的珠子在整个孵育过程中在所有管中完全悬浮。 短暂地使管离心。 转移在洗涤缓冲液2中重新悬浮的整个珠子体积，以清洁无核酸酶的PCR管。重要提示：将珠子转移到新鲜管中对于避免非目标污染非常重要。 将管子放在磁性机架上，使磁珠与上清液完全分离。移液并丢弃上清液。 密封管并短暂离心。返回磁性机架并使用 10 μl 移液器去除任何残留洗涤缓冲液。 执行第三室温洗。 加入150 μL室温1x洗涤缓冲液3。 上下移移 10 到 20 次，以完全重新悬浮珠子。 密封管并孵育2分钟，在轻轻涡旋30秒和休息30秒之间交替。确保所有井中的珠子在整个孵育过程中在所有管中完全悬浮。 短暂地使管离心。 将管子放在磁性机架上，使磁珠与上清液完全分离。移液并丢弃上清液。 密封管并短暂离心。返回磁性机架并使用 10 μL 移液器去除任何残留洗涤缓冲液。 从磁性机架中取出，向磁珠中加入 20 μL 无核酸酶水。 上下移液10次，以确保任何珠子卡在管的一侧已重新悬挂。 重要提示：请勿丢弃珠子。在步骤 19 中使用整个 20 μL 的重新悬浮珠子，并捕获DNA。 19. 执行最终、捕获后 PCR 浓缩 根据下表准备捕获后 PCR 主组合，乘以所需样本数，并额外添加 10%。 捕获后 PCR 主混合组件 体积 （μL） 捕获后 PCR 主混合 25 捕获后 PCR 底漆组合 1.25 无核酸水 3.75 总容量 30 表 15：捕获后 PCR 主组合。捕获后 PCR 主混合组件应根据显示的体积在冰上组装和混合。 在每个样品中加入30μL的捕获后PCR主混合物，最终反应体积为50μL。通过上下移液10次彻底混合。 将 PCR 管放入热循环器中，按照计划#11进行孵育（补充表 2）。 20. 净化捕获后 PCR 碎片 在使用前，让 SPRI 珠加热至室温至少 30 分钟，然后涡旋 SPRI 珠约 30 秒重新悬浮。 在每个PCR富集捕获（50 μL）中加入75 μL的再悬浮珠子。通过上下移液至少10次，将混合良好。链球菌珠不会干扰SPRI珠的纯化。在室温下孵育5分钟。 在微离心机中短暂旋转管，并将管放在磁性机架上，将珠子与上清液分离。溶液清除后，小心地取出并丢弃上清液。小心不要打扰含有DNA的珠子。 在磁性机架中，将 180 μL 新鲜制备的 80% 乙醇添加到管中。在室温下孵育30s，然后小心地取出并丢弃上清液。 重复步骤 20.4 一次，共执行 2 个洗涤步骤。 完全去除残留乙醇。将管子放在磁性机架上，在盖子打开后晾干 3 分钟，或直到明显干燥。不要过度干燥珠子。这可能导致DNA的恢复率降低。 从磁铁上取下管子。通过加入22 μL的0.1x TE缓冲液，从珠子中释放DNA。通过上下多次移液，将混合良好。在室温下孵育2分钟。将管子放在磁性机架上，直到溶液清除。 去除20μL的上清液，并转移到一个干净的无核酸酶PCR管，小心不要干扰珠子。这是协议中的一个可选停止点，库可能存储在 -20°C。 21. 验证和量化库 使用荧光计和高灵敏度测定套件测量捕获的库的浓度。 使用数字电泳高灵敏度DNA芯片测量捕获库的平均片段长度，并使用系统软件计算每个库的平均片段大小。平均片段大小应约为 250-400 bp（参见代表性结果，图 6和图7）。这是协议中的一个可选停止点，已完成的库可以存储在 -20°C。 22. 测序平台上的测序 对于排序，将库稀释到 2 nM，并遵循制造商加载和操作音序器的指南。序列库到最小深度为 1500 万的单端读取至少 50 bp 的长度。 23. 使用棱镜门户（基于云的信息学工具）分析测序数据以生成免疫配置文件和发现生物标志物 通过访问https://prism.cofactorgenomics.com/创建棱镜帐户 登录后，单击 Prism 中任何页面顶部工具栏中的”提交新项目”以上载已解构的 FASTQ 排序文件，或使用棱镜帐户上载存储在 BaseSpace 上的文件。 填写”新项目”窗体，包括项目名称以及按组或组组进行的示例。生成生物标志物发现报告时，需要对样本的分组和相应的分组名称。请注意，每组至少需要 3 个样本才能生成生物标志物发现报告。单击”启动应用程序”按钮提交表单;如果成功，将显示一个确认页面。 登录时，单击顶部工具栏或棱镜的任何页面中的结果。Prism 使用户能够查看已提交项目的状态，并查看每个项目的样本和生物标志物报告。将有一个用户在棱镜上创建的项目表。该表有三列用于状态、名称和提交日期。注： 每个项目的状态可以是：• “运行”，其中项目分析当前正在运行，或者，• “成功”，其中项目分析已完成，报告可用。 如果项目已完成分析（以”成功”状态表示），请查看单个示例报告和生物标志物发现报告。请注意，只有当项目包含每组所需的至少三个样本时，生物标志物发现报告才可用。 要访问这些报告，请返回到项目表并单击项目名称。在”项目”页上，将有一个表，其中每个示例都有一行。单击”报表”列下每一行中的链接，以访问每个示例的”单个报表”。在表格的下方，单击生物标志物发现报告的链接。如果此页面中没有链接，则项目尚未完成分析。