正交胰腺肿瘤的产生与肿瘤渗透T细胞细胞毒性的外体特征

根据1986年英国内政部动物和科学程序法以及2010/63/EU欧洲指令，正交性胰腺肿瘤如前所述产生。所有小鼠都接受术前监测疼痛或痛苦的迹象，包括但不限于体重减轻（> 15%，在72小时或20%在任何特定时期），皮毛，眼睛变窄，步态升高，驼背外观，以及伤口感染的迹象，包括出血，发红和溃疡。肿瘤生长通过触觉监测，其他临床症状，如人工呼吸，黄斑和冷四肢也被监测，以评估是否达到终点的迹象。所有程序都应在无菌条件下进行。流式细胞染色前使用的所有试剂都应在无菌条件下制备。 1. 注射用肿瘤细胞的制备 从-20°C取基底膜的等分，在4°C的冰上过夜。注：基底膜浓度可能因批次而异;因此，必须在体内测试很多特定的基底膜批次，以确保可重复性。一批新的基底膜在4°C的冰上解冻，然后在用户定义的等分中，在冰上，然后进一步储存在-20°C，直到需要。这样，在使用基底膜时，可最大限度地减少移液和冻融。 将无菌 PBS 置于 4°C 过夜以冷却。 将无菌 200 μL 和 1000 μL 移液器吸头置于 -20°C 过夜以冷却。 使用无支原体的肿瘤细胞，在解冻后和收获前生长的日志阶段至少生长2-10个通道。该协议使用雌性鼠C57BL/6 KPC衍生的细胞系：TB32048作为慷慨的礼物由大卫·塔夫森实验室提供。 当收获需要肿瘤细胞时，在PBS中从烧瓶中取出培养基并洗涤细胞两次（预热至37°C）。 在37°C（到T175烧瓶中，加5 mL）在烧瓶中加入2x胰蛋白酶（预热至37°C）10分钟。 10分钟后，通过轻轻敲击烧瓶并在介质中重新悬浮，向烧瓶和分离细胞中加入同等体积的完整介质（10S、1x 青霉素、DMEM 中的1倍链霉素）。 在300 x g和室温（RT）下将细胞转移到管和离心机5分钟。 取出上清液，并在完整的培养基中重新悬浮细胞，以便细胞计数。 在300 x g和RT下再次离心细胞5分钟，并去除上清液。 在预冷冻PBS中重新悬浮细胞，达到1×106细胞/mL的浓度。注：此库存浓度准备在 5 μl 中最终注射浓度为 1000 个细胞。我们发现，在低注射量下注射数量较低的细胞最大限度地减少了细胞泄漏，因此增加了可重复性，但是，肿瘤的生长可能是细胞系依赖性的，因此用户应优化每个细胞系。 除此之外，将预先引用的地下室膜等分放在冰上，放入发动机罩。 注射准备的PBS中基底膜、PBS和肿瘤细胞的最终溶液比例为5：3：2。因此，在基底膜的500μL等分液中，使用预冷却的1000μL移液器尖端添加300μL的预冷却PBS。 将 PBS 直接添加到地下室膜等分，以尽量减少移液。 将 p1000 设置为 300 μL，并重新悬浮 PBS 和地下室膜，确保将管保持在冰上，以保持地下室膜处于液态状态。 完成从 p1000 尖端弹出所有地下室膜后，将尖端留在管中，让任何地下室膜/PBS从移液器尖端下。 5-10分钟后，将更多的基底膜从p1000尖中弹回管子中，让管子放在冰上。 在PBS中取取200μL的再悬浮肿瘤细胞，并使用预冷却的200μL移液器尖端直接添加到基底膜中。 取一个新鲜的预冷却 p1000 移液器尖端，将移液器设置为 300 μL，然后重新悬浮 30-40 次。较大的移液器尖端（设置在低体积上）更可取，因为地下室膜可以在重新悬浮期间向上移动，并触摸移液器尖端过滤器。 肿瘤细胞准备注射。手术期间将肿瘤细胞/基底膜放在冰上。 2. 肿瘤细胞的正交注射 在动物设施中使小鼠适应7天。 手术前约2小时，刮伤腹部和背部的左侧，然后在颈部刮毛下进行术前镇痛（50-100微克/千克的布丙诺啡）。 准备手术现场，用热垫将鼠标放在一起，并覆盖周围设备和鼠标的窗帘。消毒所有手术工具;为每个鼠标准备足够的工具集。 将鼠标放入带有 O2腔室的 5% 无氟胶，直到失去知觉。 将鼠标（躺在其背上）转移到热垫上，并使用面罩维持麻醉，通常以较低的2-3%的离形剂。 确认深层麻醉;当后爪被捏住并监测呼吸速率保持不变时，通过踏板退步反射的丢失来识别。 用窗帘盖住身体，只露出被遮盖的部分。确保鼠标牢固地在麻醉面罩中。 使用无菌棉芽，在被覆盖区域以圆形运动添加碘溶液：从中心开始，向边缘盘旋。再次重复处理新鲜棉芽和碘。 使用手术刀在胰腺/脾脏位置（左上象限）上方进行 1 厘米切口。无菌剪刀也可用于切口（如果愿意）。 用钳子把皮肤拉开。使用新的钳子，找到围肠壁，并使用剪刀通过围肠壁再切1厘米。 使用第二对钳子从体内提取胰腺，这可能与脾脏一起。 轻轻反转肿瘤细胞/基底膜的瓶数次混合。 在地下室膜中用含有1，000个肿瘤细胞的5μL制备玻璃注射器，并在热垫上放置几秒钟，使其温暖。注：注射器的短暂加热将使地下室膜开始凝固，使其更容易注射而不会泄漏。然而，这必须保持简短，如果离开太久，地下室膜将完全凝固，不会注射。使用玻璃注射器可以精确注射低体积。 将胰腺放在尾部以将其伸出，然后将针头直接插入胰腺中心，与胰腺本身平行，努力避免可见血管。注：胰腺中心有大面积，最容易注射。然而，胰腺的头部或尾部也可以特别注射，如果首选。 将5μL的基底膜缓慢注入胰腺，并在注射后将针头稳定在胰腺中至少30s，使基底膜凝固并防止渗漏。基底膜应可见，因为小透明气泡将形成;但是，它可能不可见。注：可注射大体积肿瘤细胞/基底膜;但是，必须测试确切的体积，以确保不会发生泄漏。 从胰腺中取出针头，等待确认没有出血。轻轻地将胰腺插入腹腔，注意不要接触地下室膜气泡。 将围肠壁拉在一起，执行单缝合线，如果需要，执行两个中断缝合。 将皮肤切口的两侧拉在一起，根据需要执行多个中断缝合或插入两个手术夹。 再次将丁丙诺啡皮下注射到刮毛中。 将小鼠转移到加热的 37°C 保持架内至少 30 分钟，在手术后保持体温，然后再移回新的笼子。 在笼子里准备一种混合饮食，以确保补液和体重。 建议重新管理术后痛感，并密切注意伤口开口、疼痛或感染和体重减轻的迹象。如果使用手术夹，可以使用夹子去除器在 7-10 天后将其取出。 大约14天后，疤痕组织将愈合到足以开始对腹部进行小口。通过触觉密切监测肿瘤大小，直到小鼠到达终点。 在终点，小鼠通过宫颈脱位进行剔除，然后斩首。皮肤和围肠腔用剪刀打开，胰腺肿瘤用钳子切除，用钳子抓住肿瘤，用剪刀切除周围组织。 3. 胰腺肿瘤的消化 将解剖的胰腺肿瘤、转移位点肿瘤或健康的胰腺组织置于冰冷的PBS中，并储存在冰上。 使用钳子将肿瘤转移到培养皿上。 将5.0 mL的消化介质（2毫克/mL胶原酶，0.025毫克/mLDNase RPMI）加入50 mL管中;储存在冰上，以防止酶活性开始。注：此协议使用胶原酶V型，其活性为+1单位/毫克FALGPA和>125胶原蛋白消化单位（CDU）/毫克固体。胶原酶和DNase等分可以储存在-20°C，并在使用前在冰上解冻。当两者都在无菌 RPMI 中完全溶解时，它们可以通过 0.2 μm 过滤器去除污染物。胶原酶在过滤前必须完全溶解，以避免材料损失。 采取这个溶液的小等分，以覆盖培养皿上的肿瘤。 使用无菌手术刀和钳子将肿瘤切成小块，长度大约小于3毫米。 将肿瘤片片刮入管中，轻轻倒置管，直到所有片件都浸入消化介质中。如果其他肿瘤样本需要分批制备，则储存在冰上。 在37°C下转移到摇动装置上20分钟。确保所有肿瘤被浸没，不要粘在管的边缘。如果无法晃动，则每 5 分钟涡旋一次样品以帮助消化。 4. 从消化肿瘤中制备单细胞悬浮液 在消化步骤之后，立即将管子放在冰上以减缓酶活性。 加入EDTA，最终浓度达到20 mM，并短暂涡旋样品混合。这将进一步减缓酶活性。 打开管，用新鲜的RPMI培养基冲洗管盖上的任何肿瘤消化。 在冰上 50 mL 的开管上准备 70 μm 滤网（滤网的 μm 大小可根据需要改变）。 用介质预湿过滤器。 重新悬浮消化的细胞，并使用25 mL或更大的条纹清洗管的侧面。条纹的更宽开口对于使厚层易于通过非常重要。 使用 25 mL 条纹将所有摘要转移到滤网上。 使用 1 mL 注射器柱塞将肿瘤捣碎在过滤器顶部。只直接上下混合，以尽量减少对细胞的剪切应力。 使用 RPMI 通过滤网持续清洗细胞。确保用足够的力洗涤，以推动细胞通过。 如果仍有要混料，但 RPMI 停止冲洗，则滤网将饱和。因此，将样品转移到新的筛选器中并继续。注：最终只有细胞外基质分量将留在过滤器中，所有单个细胞都应该通过。 在 300 x g和 4 °C 下将管离心 5 分钟。 小心地将细胞颗粒重新悬浮在完整的 RPMI 中，然后直接通过另一个过滤器，以去除任何无法充分重新悬浮的细胞外基质或大细胞团块。 此时，如果不需要刺激，请立即通过跳到步骤 6.1 来染色分离的细胞，以便进行流式细胞分析。或者，将它们重新悬浮在冷冻介质中（FBS中为10%DMSO），然后储存在-80°C，然后长期储存在液氮中。注：冷冻步骤可以允许在以后纯化免疫细胞;然而，免疫细胞子集的定量可能需要优化，以确认细胞数和表型不受冻结/解冻过程的影响。前体T细胞刺激最好在新鲜肿瘤样本上进行。此时，样品可以通过基于珠的死细胞去除或免疫细胞富集测定（如果需要）进一步纯化。 5. 为细胞进行外体刺激准备 计算细胞在完整介质（RPMI 10 % FBS、1X 青霉素和 1X 链霉素） 中的浓度为 2 x 106/ 100 μL。注： 镀层细胞总数高，可确保本示例中有足够的 T 细胞进行分析。但是，根据样品可用性和感兴趣的 T 细胞子集的罕见性质，可以向上或缩小该数量。 U 底 96 孔板中 100 μL 的电池板。 加入含有2倍PMA/碘霉素制备的完整介质100μL（根据制造商的建议，分别达到最终浓度0.081μM和1.34μM）。注：如果测量脱粒/外泄，请在此处在介质中加入荧光结合抗小鼠CD107a。还必须执行不包含 CD107a 的控制样本。 放入 37 °C 培养箱中，5% CO2可放置 1 小时。 在完整介质中分别加入20 μL的10倍制备的布雷芬A和莫嫩辛（分别达到最终浓度1.06μM和2.0μM（根据制造商的建议）。注：布雷费尔丁A和莫嫩辛是蛋白质运输抑制剂，因此阻止细胞因子细胞外释放等，允许通过流式细胞测定检测。如果通过 ELISA 或类似方法测量细胞因子释放到上清液中， 则可以跳过此步骤。 将板放入 37°C 的培养箱中，其中 5% CO2可再放置 4 小时。 6. 流式细胞学的细胞外和细胞内染色 拆下板并重新悬挂每个孔，将所有材料转移到放在冰上的 V 底板上。注：表皮细胞、巨噬细胞和其他附着细胞可能无法通过重新悬浮完全恢复。然而，由于下游分析仅在 T 单元上，因此这不是问题。 6.1.1 在 300 x g和 4 °C 下将板离心 5 分钟（除非另有说明，否则使用这些条件执行后续步骤）。 在一次剧烈运动中将板倒置，取出上清液。 在50μL的可修复活力染料中重新悬浮，在冰冷的PBS中制备。重新悬挂时，将移液器设置为较低的音量，以避免出现气泡。 在黑暗中，在4°C下孵育20分钟。 洗涤步骤：加入100 μL的FACS缓冲液，离心机并去除上清液。 在FACS缓冲液（0.5 % BSA，2.0 mM EDTA中，在PBS中）用50μL的抗CD16/CD32（2.5 μg/mL）重新悬浮每口井，以阻止检测抗体与Fc受体的非特异性结合。 在黑暗中，在4°C下孵育15分钟。 在FACS缓冲液中直接为每个孔添加2x荧光铬结合抗小鼠CD45、CD3、CD4和CD8（可根据需要添加进一步的细胞外标记） 在黑暗中，在4°C下孵育30分钟。 洗涤步骤：加入100 μL的FACS缓冲液，离心机并去除上清液。 加入100 μL的1x细胞内（IC）固定缓冲液，在黑暗中在RT孵育30分钟。 在 RT 处准备离心机。 加入100 μL的FACS缓冲液，在300 x g和RT下离心5分钟，并去除上清液。在300 x g下用1x渗透缓冲液和离心机重复5分钟;然后删除上清液。 加入50μL的1x主混合物的氟铬结合抗小鼠IFN®，TNF®，和其他细胞内标记制备在1x渗透缓冲液。 在RT下，在黑暗中孵育1小时。 加入100 μL的渗透缓冲液进行洗涤。然后在300 x g和RT下离心5分钟，并去除上清液。 加入100 μL的FACS缓冲液清洗，在300 x g和RT下离心5分钟，并去除上清液。 在此最终离心后，在与流细胞计兼容的体积中重新悬浮细胞。它可能因 FACS 管的大小而异。 将此卷转移到适当的 FACS 管中进行采集。 从光盖和存储在冰箱和获取样品在24小时内。